芍藥甘草湯含藥血清對哮喘大鼠T淋巴細胞凋亡及p-Akt磷酸化表達水平的影響*

何 飛 汝觸會 鄭 琦 季也民 徐儉樸 蔡宛如

1 浙江省中西醫結合醫院 浙江 杭州 310003

2 天臺縣人民醫院 浙江 天臺 317200

3 浙江中醫藥大學附屬第二醫院 浙江 杭州 310005

支氣管哮喘是一種具有異質性慢性氣道炎癥性疾病，發病人數眾多，傳統中醫藥在支氣管哮喘防治方面具有較好效果[1]，芍藥甘草湯作為著名經方之一，目前已廣泛應用于臨床，我們前期研究發現其能調節哮喘大鼠Treg/Th17細胞失衡的作用[2]。本項目運用血清藥理學方法，利用體外實驗觀察芍藥甘草湯含藥血清對哮喘大鼠T淋巴細胞凋亡及淋巴細胞p-Akt水平的干預作用，以研究該經方防治支氣管哮喘的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物：SPF級雄性SD大鼠，體質量250±20g。由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供［動物生產許可證號SCXK（滬）2013-0016］。飼養條件：恒溫，溫度22±2℃，濕度50%～60%，光照每12小時明暗交替，換風次數15～20次/小時。由浙江中醫藥大學動物實驗研究中心飼養［實驗飼養室許可證號SYXK（浙）2013-0184］。實驗動物的處置嚴格按照浙江中醫藥大學動物實驗中心的倫理相關規定進行。

1.2 試劑及儀器：芍藥甘草湯由浙江省中西醫結合醫院制劑室制成流浸膏（芍藥和甘草的比例1∶1）,生藥含量1g/ml；卵白蛋白（Sigma公司，貨號：SLBB5992V）；氫氧化鋁（Thermo公司，貨號：77161）；P-AKT抗體（Affinity公司，貨號：AF0908）；PI3K抑制劑 LY294002（sigma公司，貨號：19-142）；CO2培養箱（SANYO公司，XD-101）；流式細胞儀（Becton-Dickinson公司，FACS Calibur）；酶標儀（BioTek公司，ELx800）；核酸電泳儀（北京六一公司，DYY-6B）。

1.3 實驗方法：分述如下。

1.3.1 哮喘大鼠模型建立：SD大鼠（雄性）20只，使用腹腔注射卵白蛋白（OVA）致敏并霧化誘發建立大鼠哮喘模型，在第1天、第8天分別腹腔注射造模液1ml（含氫氧化鋁100mg、卵白蛋白100mg）致敏。從第15天開始，大鼠裝入霧化容器（30L）內，使用1%卵白蛋白激發液超聲霧化激發，時間為30分鐘/天，連續4周。于末次激發后處死大鼠，取脾臟以備T細胞培養所用。

1.3.2 芍藥甘草湯含藥血清制備：取雄性SD大鼠20只，平均分為芍藥甘草湯組與空白組，每日固定時間灌胃，灌胃前禁水禁食6小時。芍藥甘草湯組予芍藥甘草流浸膏5g/kg灌胃給藥，空白組給予等劑量生理鹽水灌胃給藥；釆用每天1次，連續灌胃7天。于第7天腹主動脈取血，收集大鼠血液，自然凝固，300rpm離心，收集上層血清，56℃滅活30分鐘，取出后進行無菌過濾，后放入-20℃箱保存，為含藥血清。

1.3.3 哮喘大鼠脾臟原代T細胞分離和培養：將脾臟剪成10mm3碎塊，置于200目尼龍網上，用一次性注射器內芯輕輕碾磨，淋巴細胞分離緩沖液沖洗；通過密度梯度離心收集淋巴細胞；將淋巴細胞分離緩沖液2ml與脾臟細胞懸液2ml，1：1稀釋后混勻，緩慢加入至含有Ficoll-Paque液試管的液面上，注意保持分層；用吸液管小心將白色的單核淋巴細胞層吸出重懸浮于RPMI1640培養基重懸培養，并進行細胞計數；然后加入尼龍毛柱中孵育60min，除去與尼龍毛結合的B淋巴細胞，收集T淋巴細胞，接種培養瓶，加入適量RPMI1640培養基，置于培養箱中培養24h，換液。

1.3.4 分組：哮喘大鼠脾臟原代T細胞分離和培養后分為6個組：空白對照組（10%胎牛血清），陰性對照組（10%不含藥大鼠血清），芍藥甘草含藥血清分為5%、10%、20%3個濃度組及 PI3K抑制劑LY294002作為工具藥物的陽性對照組。各組T細胞使用10%胎牛血清的MEM靜止同步培養24h后，分別加入空白對照血清、陰性對照血清、5%、10%、20%芍藥甘草藥物血清和PI3K抑制劑LY294002的RPMI-1640培養基。

1.3.5 MTT比色試驗法檢測各組細胞生長抑制情況：取對數生長期細胞，按不同組設定6個復孔，每孔8000個細胞接種于96孔板，并分別加入含有對應濃度的血清RPMI-1640培養基，在5%CO2、37℃培養24h。細胞處理24h后，在每孔中加入10μl的MTT，再置于37℃，5%CO2培養箱內避光孵育3～4h。孵育完成后，吸凈孔內液體，再加入200μl的DMSO溶解貼壁細胞，置于搖床室溫震蕩10min。在λ=490nm采用酶標儀測定各組同一時間點的OD值，最后進行細胞增殖影響的分析。

1.3.6 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率：將對數生長期的細胞消化接種到6孔板中，次日待細胞貼壁后，根據組別，設置加入相應的含藥培養基，藥物作用后，用0.25%胰酶（不含EDTA）消化收集細胞；用PBS重懸細胞2次，2000rpm離心5min，收集5×105細胞；加入500μl的Binding Buffer懸浮細胞，接著加入5μl的Annexin V-FITC混勻后，避光，室溫孵育15min；再加入5μl的PI染色，輕輕混勻細胞，于避光條件下室溫孵育10min，用流式細胞儀檢測細胞凋亡的情況。

1.3.7 流式細胞儀測定各組細胞周期：取細胞濃度為1×105cells/ml的細胞懸液，按上述實驗分組處理細胞后，接種于6孔細胞培養板中，每孔加入3ml細胞懸液，置于37℃，5%CO2細胞培養箱中培養24h；將孔板中的細胞經胰酶消化后，收集至離心管中，2000rpm離心5min，棄去上清；用2mlPBS液洗滌細胞沉淀2次；離心去上清，再加入預冷的70%甲醇1ml，4℃固定4h以上；固定好后，1000rpm離心3min，棄去上清液，再用PBS洗細胞沉淀 1次，1000rpm離心 3min；加 100μl RNase A 37℃水浴30min；再加入400μl PI染色混勻，4℃避光30min；上機檢測，記錄激發波長488nm處紅色熒光。

1.3.8 Western Blot檢測各組細胞p-Akt磷酸化水平：取細胞濃度為1×105cells/ml的細胞懸液接種于96孔板中，根據組別加入相應藥物，共孵育48小時，提取蛋白后通過Western Blot方法檢測各組細胞p-Akt磷酸化水平。使用Gel-Pro32軟件對結果進行灰度分析。

1.4 統計學方法：采用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析，所有數據以均值±標準差（±s）表示，不同組間兩兩比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）中的LSD法（最小顯著性法），P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MTT比色試驗法檢測各組細胞生長抑制情況：從表1可知，空白對照組與陰性對照組比較，兩組對大鼠T淋巴細胞生長基本無差別，排除血清這一干擾因素。與空白對照組比較，5%、10%和20%含藥血清顯著抑制大鼠T淋巴細胞生長（P＜0.01），且呈現劑量依賴性。同時PI3K抑制劑LY294002陽性對照組與空白對照組存在顯著差異（P＜0.01）。

表1 芍藥甘草含藥血清對大鼠T淋巴細胞生長抑制情況（±s，n=8）

表1 芍藥甘草含藥血清對大鼠T淋巴細胞生長抑制情況（±s，n=8）

注：與空白對照組比較，**P＜0.01。

組別空白對照組陰性對照組5%含藥血清組10%含藥血清組20%含藥血清組LY294002組抑制率（%）-1.08±1.30 6.54±2.31**11.49±4.70**23.77±0.83**42.39±0.87**OD值1.15±0.04 1.13±0.01 1.08±0.03 1.02±0.05 0.88±0.01 0.66±0.01

圖1 芍藥甘草含藥血清對哮喘大鼠T淋巴細胞凋亡的影響（n=8）

2.2 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率：空白對照組與陰性對照組比較，兩組血清對細胞凋亡基本無差別（P＞0.05），排除血清這一干擾因素。與空白對照組比較，5%、10%和20%的芍藥甘草含藥血清對促進大鼠T淋巴細胞凋亡，且呈現劑量依賴性（P＜0.01）。見圖1。

2.3 芍藥甘草含藥血清對哮喘大鼠T淋巴細胞周期的影響：空白對照組與陰性對照組比較，兩組血清對大鼠T淋巴細胞周期影響基本無差別，排除血清這一干擾因素。與空白對照組比較，5%、10%和20%的芍藥甘草含藥血清組G0/G1期細胞比例顯著增加（P＜0.01），10%和20%的芍藥甘草含藥血清組的S期細胞比例顯著增加（P＜0.01），G2/M細胞比例顯著減少（P＜0.01）。見表2。

表2 芍藥甘草含藥血清對哮喘大鼠T淋巴細胞周期的影響（±s，n=8）

表2 芍藥甘草含藥血清對哮喘大鼠T淋巴細胞周期的影響（±s，n=8）

注：與空白對照組比較，**P＜0.01。

組別空白對照組陰性對照組5%含藥血清組10%含藥血清組20%含藥血清組LY294002組G2/M（%）24.28±0.53 23.78±0.30 20.44±0.15**16.49±0.08**13.49±0.42**9.38±0.32**G0/G1（%）40.71±0.38 41.34±1.17 43.80±0.82**45.47±0.40**46.38±0.31**53.15±0.38**S（%）35.19±0.90 34.89±1.03 35.10±0.69 37.70±0.49**40.13±0.57**37.46±0.52*

2.4 各組大鼠T淋巴細胞中p-Akt磷酸化表達水平：空白對照組與陰性對照組比較，兩組的p-Akt磷酸化水平基本無差別，排除血清這一干擾因素。與空白對照組比較，5%、10%和20%的芍藥甘草含藥血清組的p-Akt磷酸化水平顯著降低（P＜0.01），而且呈現劑量依賴性。見圖2、圖3。

圖2 p-Akt磷酸化表達水平

圖3 芍藥甘草含藥血清對大鼠T淋巴細胞中p-Akt磷酸化表達水平的影響（±s，n=8）

3 討論

哮喘的發病機制較為復雜，其免疫機制研究越來越深入。T淋巴細胞在哮喘的發病過程中起到了重要作用，它不僅可能參與哮喘慢性氣道炎癥反應、氣道重塑和癥狀學，而且可能在過敏免疫反應的啟動中起中心作用[3]。細胞凋亡（apoptosis）是一種機體為維護內環境穩定而進行的程序性死亡，肺內淋巴細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞及氣管平滑肌細胞及上皮細胞等細胞的凋亡異常均參與了哮喘發病[4]。細胞周期分為分裂期（M期）和間期，其中間期包括DNA合成前期（G1期）、DNA合成期(S期)和DNA合成后期（G2期），機體細胞能否順利完成各階段交替和增殖過程受到嚴密的調控，細胞生長抑制后G2/M期比例會下降。磷酯酰肌醇3激酶(PI3K)是一種特異性激酶，PI3K/AKT信號通路參與哮喘的慢性氣道炎癥過程，抑制PI3K可有效減少哮喘氣道炎癥[5]。芍藥甘草湯是“醫圣”張仲景的經典方劑，主要治療傷寒傷陰，筋脈失養所致腿腳攣急等癥。本實驗研究表明，5%、10%和20%含藥血清組能顯著抑制大鼠T淋巴細胞生長，促進T淋巴細胞凋亡，顯著增加G0/G1期細胞比例，同時顯著降低G2/M細胞比例（P＜0.01），提示芍藥甘草湯能抑制T淋巴細胞生長，通過仰制細胞DNA的合成及有絲分裂,促使細胞由G2+M期轉至G0/G1期，減少分裂，并促進T淋巴細胞凋亡。另一方面，本實驗表明，與空白對照組比較，5%、10%和20%的芍藥甘草含藥血清組的p-Akt磷酸化水平顯著降低（P＜0.01），而且呈現劑量依賴性。PI3K抑制劑LY294002亦能顯著降低p-Akt磷酸化水平。提示芍藥甘草湯防治哮喘的作用機制可能與抑制PI3K、降低T淋巴細胞p-Akt磷酸化水平，進而減少氣道炎癥有關，但其內在機制仍需進一步研究。