麝香酮對大鼠脊髓損傷的保護研究

郭亮　桂菲　李睿夫　于超　羅遠盟

[摘要]：研究麝香酮對大鼠脊髓損傷有無保護作用。方法：將大鼠隨機均分為5組：生理鹽水組、甲基強的松龍組、M01、MO2M03組。采用改良艾倫法建立大鼠脊髓損傷模型。大鼠給予麝香酮（MO1：2.5mg/kg，MO2：5mg/kg，MO3：10mg/kg）或甲基強的松龍（MP：30mg/kg）或等量的生理鹽水。連續觀察4周，ELISA法檢測SOD、MDA、IL-1β，HE、nissl染色進行病理學觀察。結果：不同濃度的麝香酮對免疫炎癥反應、神經元壞死和凋亡均有抑制作用，MOX組下肢功能恢復優于NS組和MP組。MO2比其他組更顯著。結論：麝香酮具有抗炎、抗凋亡作用，可減輕脊髓損傷后繼發性損傷，為大鼠神經再生提供有利條件。

[關鍵詞]：抗炎藥;星形膠質細胞;膠質纖維酸性蛋白;脊髓損傷

[中圖分類號]R453 [文獻標識碼]A [文章編號]2107-2306（2020）04-062-02

創傷性脊髓損傷（SCI）的發病率有逐漸升高的趨勢"。SCI及其繼發性損傷可直接導致神經功能損傷，出現不同程度的功能障得，并且脊髓損傷治療困難！，因此致殘率與致死率非常高，不僅患者帶來不便和痛苦，也給社會和家庭帶來了沉重的負擔”。目前SCI的治療仍是醫學的一大難題，SCI的實驗研究也是醫學研究的熱點。

本實驗中觀察麝香酮對急性脊髓損傷大鼠脂質過氧化產物MDA、SoD、炎癥因子IL-1β及病理學及行為學進行觀察統計分探討麝香酮對神經元及星形膠質細胞在抗炎方面的作用。

1實驗動物

清潔級SD（Sprague-Dawley）雌性大鼠120只（由重慶醫科大學實驗動物中心提供）。隨機分成五組，生理鹽水組（NS組）甲基強的松龍組（MP組）、麝香酮注射液尾靜脈注入組（MO組分3小組：MO1-3組）。MO1組、MO2組、MO3組為脊髓損傷后立即分別從尾根靜脈注入2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg的麝香酮，持續7天;MP組術后立即注入30mg/kg的甲基強的松龍;NS組則注人等量生理鹽水。

2建立大鼠急性脊髓背側損傷模型（Allen's法[1]）

用4%水全氯醛，以0.35ml/kg行腹腔注射麻醉。其俯臥位固定，腰背部脫毛，典伏消毒鋪巾，以T9棘突為中心作長約2.5cm切口，顯露棘突及椎板，咬除T8-9棘突及全椎板，顯露脊髓，采用Allen氏重物墜落裝置撞擊脊髓背側，即將質量為10g的重錘從距脊髓2.5cm高度垂直沿中空鋼管垂直自由落下撞擊硬脊膜密切接觸，直接傳遞給脊髓。（圖1）

3取材

在相應時間點（術后3h、8h、ld、3d、1w、2w），每組隨機取3只動物，麻醉動物后在大鼠的外眥取血約lml。孵化、離心后吸取于PV管內立即放于-20度的冰箱在檢測時取出。采用酶聯免疫吸附劑測定對脂質過氧化產物丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）及白介素1B（L-1B）。

4統計

采用SARS9.0統計軟件包進行分析，所有數據以x+s表示，組間比較采用單因素方差分析，P值<0.05為有統計學意義。

5結果

5.1成功了急性脊髓損傷模型

采用Allen'S法成功建立了急性脊髓損傷模型（打擊脊髓后鼠尾痙攣性擺動數次，雙下肢及軀體回縮樣撲動，后雙下肢呈弛緩性癱瘓，大鼠麻醉蘇醒后雙下肢無活動，均需每天人工擠尿兩次）（圖1a/b）

5.2酶聯免疫吸附劑測定（ELISA）

5.2.1SOD檢測

從建模后3小時至1周，NS組SOD出現下降趨勢，從180.87ng/L降到152.85ng/L，在2周時出現上升達175.93ng/L。MP組與麝香酮處理的3個組，明顯高于NS組，都從3小時逐漸上升，在術后3天達頂峰，以MO3組最為明顯達289.45ng/L。后出現下降在2周時最明顯，以MO1組最達184.38ng/L，MP組次之。（圖2）

5.2.2MDA檢測

從建模后3小時至1周，NS組MDA緩慢上升趨勢，從3.6ng/L升到4.37ng/L，在2周時出現下降達4.18ng/L。MO1和MO2在從術后3小時至3天出現了上升趨勢，較其它3組低，以MO2最低，從2.35ng/L升至3.13ng/L，后出現了緩慢下降，以M02下降最低，達2.28ng/L。（圖3）

5.2.3IL-1β檢測

從術后3小時至1天，NS組IL-B出現緩慢上升趨勢，從66.59ng/L升到75.55ng/L，在2周時緩慢下降53.75ng/L。其余四組在同一時間點較NS組低，3小時MP組最低為37.34ng/L;2周時MO2組最低，1周時達頂峰，以MO3組相對最高，達62.49ng/L（圖4）。

5.3病理學檢查

5.3.1HE染色法

在建模后8小時400倍光鏡下能見以生理鹽水組紅細胞最明顯，甲強龍組次之，在麝香酮5mg組出血較少。1天時組織溶解明顯，從重到輕的順序為生理鹽水組，甲強龍組，麝香酮2.5mg組，組10mg組，麝香酮5mg組。3天時，生理鹽水組脊髓組織溶解，形成空洞;麝香酮2.5mg組出現了空洞，并增生出現，但較生理鹽水組好。一周、二周時脊髓組織廣泛膠質細胞增生，同一天的順序。四周時脊髓組織膠質細胞增生甲強龍組仍見散在的小的空洞存，在3個劑量麝香酮所處理的脊髓空洞基本消失，為膠質細胞所充填（圖5-6）。

5.3.2尼氏染色（Nissl染色法）

在400倍光鏡下8小時五個實驗組不同程度的出現的膠質細胞增生，生理鹽水組較多，較小的神經元。1天時膠質細胞出現增生，生理鹽水組明顯，甲強龍組次之，麝香酮以5mg組增生較少，多個較小的神經元。3天時麝香酮處理的3組膠質細胞增生較前兩組少，在這三組中以5mg組較少。一周時膠質細胞明顯增生，生理鹽水組最多，麝香酮處理的3組膠質細胞增生較前兩組少，5mg組較少，各組可見多個較小的神經元。兩周時生理鹽水組膠質細胞顯著最多，以2.5mg組增生明顯。四周膠質細胞增生5mg組較少，各組可見多個較小的神經元（圖6-7）。

5.4行為學評分

由兩名醫師同時在建模后ld，3d，1lw，2w，4w時觀察，采用BBB評分方法進行獨立評分，最后取平均值作為評分值。術后第1天，雙下肢功多處0級，隨后雙下肢功能逐漸改善，NS組在4周時達8.2，MP組達13.6，麝香酮處理后三組改善明顯優于甲強龍組.與生理鹽水組，MO2組恢復最明顯，在2周時達10.0，4周時達18.6（圖8）。

6討論

6.1脊髓損傷后繼發性損傷的病理生理

自Allen[1]提出SCI理論以來，人們對其損傷病理機制治療進行了大量深入的研究，脊髓損傷是由原發性損傷機制和繼發性損傷機制介導[2-3]。脊髓損傷中心區出現壞死，神經細胞損傷后，其輪廓能保持約6-8小時，至24小時左右基本崩解，在損傷中心區邊緣出現細胞的凋亡州。從數小時到數周內，啟動一系列細胞和分子水平的生化級聯反應，導致組織缺血、細胞死亡、軸突脫髓鞘以及膠質細胞喪增生、膠質瘢痕形成等繼發損傷。脊髓組織微循環障礙，細胞膜及細胞器損傷，離子通道失控，出現鈣內流，引起自由基反應及其介導脂質過氧化反應，并引起溶酶體及線粒體的破裂，釋放sOD、MDA等5～7，細胞功能障礙并最終死亡B”。脊髓損傷也起發免疫炎癥反應，誘導釋放大量炎癥因子如IL-1β等，使免疫、炎癥反應進一步的加重";后期特別是大量活化膠質細胞聚集，形成膠質纖維及疤痕時阻止了神經的生長，導致脊髓功能的障礙"。

麝香酮抗炎作用非常確切，并通過血腦屏障！2-1。它使單核細胞CD54分子表達及可溶性血管細胞黏附分子水平有明顯的降低，腦梗死炎癥反應得到明顯的抑制，提高了療效"。麝香酮對谷氨酸所致PC12細胞還原能力提高，抑制該細胞LDH的釋放，提高細胞存活率;抑制鈣內流;降低PC12細胞的凋亡”。中、低劑量的麝香酮能減少對氯胺酮麻醉后乳鼠海馬神經元凋亡。麝香酮有類皮質激素的抗炎作用，同時無激素的副作用，安全可靠，以及能夠通過血腦屏障，并對神經細胞有保護作用[17]。

6.2觀察指標的分析

在生理鹽水組建模后SOD處較低的水平，并逐漸下降，MDA出現了上升，在一周時達頂峰，2周有所下降;麝香酮能明顯降低MDA，提高SOD的產量，并優于甲強龍，在劑量上以5mg效果最明顯。脊髓損傷引發免疫、炎癥反應，并釋放大量炎癥因子。IL-1p在生理鹽水組出現緩慢上升，1天時達頂峰，在2周時出現下降。麝香酮處理的3個組在兩周時以M02組最低。這說明麝香酮與甲強龍有類皮質激素的作用，表現出較強的抗炎作用[18]。

6.3病理學及免疫組織化學

損傷后脊髓組織出血、消腫、固縮及壞死溶解相繼發生，并在炎癥因子及免疫反應下出現單核、巨噬細胞的浸潤、聚集，打擊區下與中央管間出現了空洞，HE染色證實了上述的病理改變。尼氏染色提示：神經元尼氏小體都出現了不同程度腫大明顯、碎裂或分布不均，及衛星現象。HE、尼氏染色都提示膠質細胞的增生。以生理鹽水組是改變最明顯，壞死明顯，空洞的擴大、神經元結構消失大，及增生的膠質細胞，甲強龍組次之。3個劑量麝香酮所處理的脊髓病理改變較輕，以麝香酮5mg/kg損傷最小，提示麝香酮處理的3組后炎癥反應被抑制，神經元的壞死及凋亡也被抑制，膠質細胞增生被得到控制。抑制了膠質細胞的增生和肥大叫。而甲強龍對細胞凋亡作用不明顯，對改判神經功能無明顯的作用？。

綜上所述，不同濃度的麝香酮對大鼠急性脊髓損傷通過抑制免疫炎癥反應，減輕了神經細胞的壞死和凋亡，抑制了星形膠質細胞的過度增生，改判了急性脊髓損傷后雙下肢的功能，以5mg/kg劑量效果顯著，并優于甲強龍，值得進一步的深人研究。

參考文獻

課題研究：課題來源于重慶市科委自然基金cstc2016jcyjA0299）

作者簡介：郭亮副教授/副主任醫師，研究生導師，研究方向;脊柱脊髓損傷