G6PD缺乏癥實驗室診斷及相關研究進展

王柏蓮　詹丹　黃麗秀　韋小榮

[摘要]：紅細胞葡萄糖～6-磷酸脫氫酶（G6PD）缺乏癥是一種伴性不完全顯性紅細胞酶缺陷病，男性半合子和女性純合子均表現顯著缺乏，女生雜合子臨床表現不一，有些表現正常，有些表現顯著缺乏。本文就當前G6PD缺乏癥的分子機制和實驗室檢測方法的研究進展進行綜述，對實驗室選擇有效和準確的檢測方法提供參考。

[中圖分類號]R730.43?[文獻標識碼]A [文章編號]2107-2306（2020）04-246-02

1.引言

G6PD缺乏癥分布世界各地，高發區為地中海沿岸國家及東南亞地區。在我國，此病主要好發于南方地區，有南高北低特點。本病是由于G6PD基因突變所致。G6PD基因位于X染色體上，男性半合子和女性純合子勻表現為G6PD活性缺乏顯著，而女性雜合子發病與否，取決于其G6PD缺乏的細胞數量在紅細胞群中所占的比例，在臨床上有不同的表現，可以表現正常，中度缺乏或顯著缺乏;女性雜合子表型的復雜性曾加了雜合子確診的難度，國內外學者圍繞著提高女性雜合子的檢出率作了很多的研究工作，提出了一些新的方法，目前研究出簡單而又能提高雜合子檢出率的檢測法，是臨床實踐迫切需要的方法。

2.發病機制

C6PD缺乏患者服用氧化性藥物誘發溶血的機制，目前認為：G6PD在磷酸戊糖旁路代謝中是6-磷酸葡萄糖（G-6-P）轉變為6-磷酸葡萄糖酸（G-6-PD）反應中必需的酶。G6PD缺乏時，使還原三磷酸吡啶核苷（NADPH）減少，不能維持生理濃度的還原型谷胱苷肽（GSH），從而使紅細胞膜蛋白中的硫基遭受氧化，破壞了紅細胞膜的完整性。NADPH減少后，使高鐵血紅蛋白（MHb）不能轉變為氧合血紅蛋白，MHb增加導致紅細胞內不可溶性變性珠蛋白小體（Heinzbody）形成增加，紅細胞膜變硬，通過脾臟時被破壞，導致溶血。

3.G6PD缺乏癥分子機制

G6PD基因位于X染色體長臂2區8帶（Xp28），全長約18.5kb，由13個外顯子和12個內含子組成，編碼515個氨基酸。女性有兩條X染色體，故有兩個G6PD基因，兩條X染色體上G6PD基因都缺乏為純合子，表現為顯著缺乏;只有一條染色體上G6PD基因缺乏為雜合子，臨床表現不一。按Lyou理論，兩條X染色體中只有一條在遺傳上是有活性的，其中一條處于失活狀態，而失活是隨機的，某一細胞的一條染色體一旦失活，這個細胞的所有后代細胞中的該條X染色體均處于失活狀態"。故女性G6PD缺乏雜合子，其G6PD酶活性并不是在RBC內平均分配，而是一群RBC擁有正常G6PD酶活性，另一群RBC則G6PD酶活性缺乏"。理論上，這兩組RBC的數量比例應該是l：1，使得RBC總體酶水平為正常人的1/2，即屬于中度缺乏狀態。但不少學者認為，這兩組RBC.的比例在不同個體并不保持1：1比例，這就使G6PD缺乏雜合子在臨床上有不同的表現度，表型可以正常，中度缺乏或顯著缺乏。故稱為不完全顯性遺傳。男性只有一條X染色體，缺乏者為伴合子，表現為顯著缺乏。

4.G6PD缺乏實驗室篩查方法

4.1定性檢測方法

4.1.1高鐵血紅蛋白還原試驗

正常還原率>0.75;中間型為0.74～0.31;顯著缺乏為<0.30。此方法操作簡便快捷，缺點是：特異性差，存在假陽性和假陰性，結果為弱陽性時，判斷容易出現主觀誤判，會出現模凌兩可情況，且溶血標本會對結果造成影響，該方法用于新生兒篩查時假陽性偏高[3]。優點是：不需要昂貴的試劑或儀器，操作簡便，可用于普查。

4.1.2熒光斑點試驗

G6PD活性正常者10分鐘內出現熒光，中間型10～30分鐘出現熒光，嚴重缺乏30分鐘仍不出現熒光。熒光斑點法優點是：敏感性和特異性較高;缺點是：操作不夠快捷。

4.1.3硝基四氮唑藍紙片法（NBT法）

G6PD活性正常者濾紙片呈紫藍色，中間型呈淡藍色，顯著缺乏者呈紅色。此方法簡便快捷，可以檢測出部分雜合子，但特異性較差響。盡管NBT紙片定性法也有過高假陽性的特點，但由于其簡便的特點，容易在基層推廣

4.1.4G6PD/6GPD比值法

C6PD/6GPD<1.00為缺乏，G6PD/6GPD>1.00為正常。

4.2.1NBT定量法：其正常值為13.1～30.0BNT單位

4.2.2G6PD/6PGD比值定量法：通常應用的有兩種方法，一是按WHO推薦的Zinkham法，同時測定G6PD活性和6PCD活性，計算G6PD/6PGD比值;二二是分別以6PG和G6P作為底物，用NBT定量法分別測定G6PD活性和6PGD的活性，計算G6PD/6PGD比值。其正常值為：WHO推薦法：G6PD/6PGD>0.95;NBT法：G6PD/6PGD>0.98（新生兒》1.09）。G6PD/6PGD比值可以進一步提高雜合子的檢出率"。是目前檢測G6PD酶活性缺乏較為理想的方法。

4.2.3G6PD酶活性測定法（速率法）：抗凝血離心取紅細胞層20ul于含有Iml溶血劑試管里，待紅細胞溶解后立即上生化儀檢測（注：紅細胞溶解到上機時間約8分鐘，最長必須在25分鐘內完成）G6PD活性單位為U/L，<1300U/L為缺乏，>3600為增高，介于二者之間為正常，G6PD酶活性測定是通過單位時間生成NADPH的量來反映紅細胞G6PD的活性。該方法檢出率沒有比值法高，但速率法可以在自動生化分析儀上重復檢測，重復性測量避免誤差是其他方法所沒有的。

4.3幾點結論

以上是目前臨床常用于G6PD酶缺乏檢測的方法，基本原理都是直接或間接檢測G6PD酶的活性。雖然由定性向定量不斷改進，但是對雜合子檢出效果還是較差"-10，1991年由杜傳書教授提出的比值法，在其小樣本試驗中雜合子檢出率可達69.1%"，漏檢率31.9%;胡淑芬等采用從G6PD缺乏男嬰追溯其母親酶缺乏報道的漏檢率33.3%”。鑒于傳統方法對雜合子檢出難度大，漏檢率高，國內外學者在雜合子檢測方法上做了很多探討，基于G6PD缺乏癥發生的分子機制和分子生物學技術在醫學領域的廣泛應用和迅速發展，G6PD缺乏癥的研究進人基因檢測時代。

5.基因檢測

5.1對已知G6PD基因突變位點篩查的方法

5.1.1位點特異性寡核苷酸探針雜交法（ASO）。該法簡單易行，但雜交和洗脫條件控制不好時，經常出現假陰性或假陽性，且需要同位素。

5.1.2臺灣張建國等建立的錯配PCR/RE酶切法。該法特異性很高，但方法繁瑣，有些限制性切酶較昂貴，最重要的是常出現酶切不完全現象。

5.1.3突變特異性擴增系統（ARMS）。此法簡便、快速、準確、經濟，一次PCR即可檢出結果。但此法對引物設計要求高，各突變位點需要進行各自PCR反應，不能同時檢測多個位點。

5.1.4高分辯率熔解曲線法（HRM）。HRM是近年發展起來的一種簡便、快速、高通量、價廉的基因突變篩查檢測技術"，是猶他大學和愛德華科技公司于2000年合作開發出的一項新的突變/SNP檢測分析技術"。HRM可以準確地檢測己知突變位點，又可以發現新突變位點及多態性，自動化程度高。不足之處是對于G6PD缺乏癥基因型分布及揭示地區人群起源和遷徙有明顯不足，對PCR反應、熔解儀器、熒光染料要求較高，突變掃描不能精確區分擴增片段中不同雜合突變”。

5.1.5多重SNaPshot基因分型技術，也稱微測序。此方法結果清析直觀，易于判讀，對擴增產物進行各位點微測序，準確性及特異與金標準測序相當"，且成本低，操作簡單快捷，自動化程度高。不足之處：檢測需要特殊設備且設備昂貴

5.1.6PCR+導流雜交技術。該方法通過對血液進行DNA提取及擴增，最后對擴增產物進行導流雜交達到基因分型的目的，能同時檢測14突變，覆蓋中國人群90%以上常見突變位點，操作簡便，便于擴容，能準確區分雜合與純合突變"。

5.1.7熒光定量PCR檢測法。該方法有快速、簡單、價格低廉、準確可靠、可提高雜合子檢出率、的特點[18]，適合臨床篩查。該方法通過擴增曲線的“有”“無”確定樣本是否有突變，根據熒光曲線的顏色判定突變點信息。該方法局限性：受到引物和特異識別探針設計的局限性，只能檢測復蓋中國人群常見的突變位點，對稀有突變會漏檢。

5.2對未知突變的篩查方法

5.2.1單鏈構象多態性分析法（sSCP）和變性梯度凝膠電泳（DGGE）

SSCP和DGGE可以篩選出可能發生變異的外顯子，然后通過測序確定變異的堿基，但sSCP和DGGE各種實驗條件的變化對實驗結果影響大，目前尚無法根據已知序列來預測某一片段的最適條件，故敏感度低，少見或新的變異漏檢率高。

5.2.2變性高效液相色譜法（DHPLC）四。此法特異性和敏感性均高于前兩者，且重復性較好，可在常規半變性條件下用于篩查DNA片段中的未知突變外，還具備在完全變形條件下分離長度僅相差一個堿基的短片段單鏈及長度相等僅有一個堿基不同的DNA或RNA的性能。

5.2.3DNA測序法。是檢測基因突變的金標準。檢測成本高，一般用于科研。

6.結語

G6PD酶缺乏的實驗室檢測從開始的直接或間接對酶活性檢測到基因檢測，最后到DNA直接測序。酶學檢測法對女性雜合子漏檢率高，基因檢測法雖然提高了雜合子的檢出率，但對稀有突變和未知突變存在漏檢，DNA測序法是金標準，但檢測成本高，目前一般用于科研。簡單而準確的檢測G6PD缺乏癥，且適合大規模篩查和臨床使用的檢測方法仍然是臨床實踐中迫切需要的方法。隨著分子生物學技術在醫學檢驗的迅速發展，給G6PD缺乏癥的分子診斷帶來了突飛猛進的變化。每種分子診斷方法各有其優缺點，各實驗室可根據具體情況，選擇適合的診斷方法，對于女性患者，篩查時優先采用分子診斷技術可減少大量病例漏診[20]。

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通迅作者：韋小榮，副主任技師，2951025534@163.com