細胞內生物大分子的相分離研究進展

李惠，劉慶喜，李新軍，矯強，馬文建,2

·綜 述·

細胞內生物大分子的相分離研究進展

李惠1，劉慶喜1，李新軍1，矯強1，馬文建1,2

1 齊魯理工學院，山東 濟南 250200 2 天津科技大學，天津 300457

細胞內生物大分子的相分離 (Phase separation) 現象是近幾年受到極大關注的新興研究領域。作為一種細胞生化反應的聚集分割機制，其在自然界中廣泛存在，參與基因轉錄調控，影響生物體對外界刺激的應答等重要生理過程。相分離失調可能導致一些重大疾病的發生，諸多交叉領域的研究者正試圖通過相分離這個全新角度來審視老年癡呆等相關疾病，探索其發生的分子機制以及通過相分離進行干預和治療的潛在可能性。文中擬介紹該領域最新研究進展，從生物相分離現象的發現、生化基礎及其與疾病發生的聯系等方面，綜述目前的主要研究方向，并對該領域擬解決的關鍵問題進行展望。

相分離，生物相變，細胞分子凝集，相分離失調

生物大分子的“相變”或稱“相分離”是近年來生命科學領域新興的發展方向。相分離本是一個物理化學常見現象，當二元系統打破其穩定而均勻的單相狀態時，會發生相分離。如同把水和油置于同一容器時，會出現分層現象。近年來發現，細胞液里的不同生物大分子成分也會相互聚集分離，形成液滴狀結構[1]，這就是所謂的“相分離”。通俗地說，是細胞內蛋白等生物大分子作為固體顆粒，所表現出的液滴具有的性質 (流動性、可融合和分散)，相互之間可發生融合，聚集在一起形成發揮特定生物功能的液滴狀結構，其雖然沒有細胞膜狀結構圍繞，但通過聚集形成類似于細胞器的獨立空間，是一種在化學結構基礎上產生的物理現象。

2009年，Hyman和Brangwynne研究線蟲性腺中RNA和P顆粒形成小球的過程中，首次觀察到P顆粒并非通常所認為的固體化內核的蛋白，P顆粒之間可以像液滴一樣相互碰撞、融合，表現出類似于液體的物理性質，也即存在“液-液相分離”現象[2]，此后圍繞“相分離”的生物研究逐步開展起來。2012年Michael Rosen和Steven McKnight發現，在體外試管中通過改變生物化學條件，可以重現體內的“相分離”現象[3-4]，是相分離領域的突破性研究進展。然而伴隨生物體內“相分離”研究的開展，一直面臨很大爭議，特別是這種現象是否在細胞內普遍發生是疑問的焦點。近年來隨著技術的不斷更新和推進，越來越多的證據證實了生物相變這一現象的存在，“相分離”成為目前熱門的前沿生物研究領域，被雜志評為2018年十大科學突破。

“相分離”涉及到細胞活動的很多方面，細胞DNA的組裝、DNA損傷修復、RNA轉錄以及細胞膜上的信號轉導等生命活動都存在這一現象?！跋喾蛛x”會隨著細胞滲透壓等情況的改變發生變化，以應對細胞所面臨的不良條件。異常的“相分離”會導致多種疾病的發生，如神經性退行疾病、癌癥等。關于其具體的表征和理化特性，Salman等提出了“生物分子縮合物”的概念，來歸類“相分離”形成的分子聚集體。根據分子的聚集和獨立兩個特征，概括了包括細胞體、核體、無膜細胞器、顆粒、斑點、聚集體、組合物和膜斑點在內的各種無膜區室[5]。當然，鑒于這是近年來新興的研究領域，更多的共性表征，特別是個性表征，目前尚沒有很多非常明確的界定。這些“生物分子縮合物”在細胞核、細胞質、細胞膜上均有分布。

目前，“相分離”的研究內容還主要集中在發現新的可發生相分離的生物大分子，以及其發生相變的影響因素，包括物理、化學、生物等。進一步研究相分離分子的化學結構特點，并揭示其導致的生物功能變化，以及與衰老和神經退行性疾病之間的聯系，是非常吸引人的研究課題。

1 生物分子相分離現象的生化基礎及其影響因素

在水溶劑中，生物大分子之間通過各種相互作用力使親和力更強，從而形成相分離現象 (見圖1所示模式圖，參考自文獻[5]并稍作修改)，這些作用力包括：酸堿性束之間的靜電相互作用 (圖1A，P顆粒中的Laf-1)，多肽β-鏈之間的多肽骨架相互作用 (圖1B，Fus、hnRNPA1/2)，芳香族和堿性殘基之間陽離子-π相互作用 (圖1C，DEAD-box解旋酶4，DDX4)[6]，多嘧啶束結合蛋白與RNA中的UCUCU束 (圖1D，PTB-RNA)，結構域間的寡聚化 (圖1E，EDC3-DCP2，NPM1-R-motifs，SynGAP-PSD-95) 以及模塊化的結構域之間的相互作用 (圖1F，Nck and neural Wiskott-Aldrich syndrome protein，N-WASP)[7]。生物大分子一般通過一種或多種作用力實現生命活動中的相分離，而由不同機理引起的相分離現象其發生條件不同，有些相互作用是有條件的，需要在細胞內特定條件下完成，如通過結構域相互作用的蛋白，這些蛋白的結構域通常富含脯氨酸 (Pro)、賴氨酸 (Lys)、苯丙氨酸 (Phe)、色氨酸 (Trp)、酪氨酸 (Tyr) 等氨基酸，通過其特殊的R基團來實現分子間的相互作用；另一種無條件的可以在體外發生相分離的蛋白則含有大量無序區，被稱為固有無序區 (Intrinsically disordered regions，IDRs) 或低復雜性序列 (Low-complexity (LC) sequence)，其特點是序列復雜性低并且由特定氨基酸類型組成，主要包括甘氨酸 (Gly)、絲氨酸 (Ser)、谷氨酰胺 (Gln)、天冬酰胺 (Asn)、苯丙氨酸 (Phe) 和酪氨酸 (Tyr)，有些還含有帶電殘基賴氨酸 (Lys)、精氨酸 (Arg)、谷氨酸 (Glu)和天冬氨酸 (Asp) 等[8-9]。

除了蛋白本身的化學結構決定了能否發生“相分離”外，其發生還與蛋白分子的濃度、溶液的酸堿度、鹽濃度及溫度有關，低鹽濃度可以促進相分離[10-11]。在對Fus、hnRNPA2等通過IDR介導相分離的蛋白的體外相分離實驗中，發現其不僅會發生液態的相分離，在低溫條件下 (4 ℃)還會發生過度聚集形成水凝膠，甚至在低pH條件下會形成無法逆轉的沉淀。這些液態、水凝膠、沉淀的形成與解聚條件也與不同分子間氨基酸的組成及甲基化、磷酸化程度相關，如酵母Sup35蛋白形成的凝膠相較其他蛋白來說對SDS的耐受性更強[4]，Fus蛋白中精氨酸低甲基化時強烈促進相分離和凝膠化[12-13]，Hp1α蛋白去磷酸化后“相分離”能力減弱[14]，同時，這些蛋白的原纖維化也會受到其他相關蛋白甚至DNA、RNA的調控，如Karyopherin-b2蛋白[15-16]、DNA依賴性蛋白激酶DNA-PK[17]、Laf-1蛋白結合的RNA等[18]。

圖1 相分離分子作用力模式圖[5]

因此，可以通過蛋白序列中氨基酸的組成特點來預測生物大分子是否可以發生相分離，或者通過改變氨基酸的組成和修飾來改造蛋白結構，進一步影響其相變特征，如在Fus中增加精氨酸數量則可以在高鹽濃度下發生相分離，而將精氨酸和酪氨酸突變則不能發生相分離[16]。而改造蛋白結構是一種治療因相分離異常所引發的疾病的一種潛在方案，對相關蛋白發生相變的生物化學基礎的研究也對相關疾病藥物的開發具有指導意義，如蛋白的磷酸化抑制劑等。

2 相分離的生物學意義

相分離現象的發生貫穿于細胞的整個生命進程中。細胞的增殖是從有絲分裂開始的，染色質疏散暴露出DNA以方便復制，此后再組裝為結構更加緊密的染色體進行聯會，將遺傳物質分配到兩個新的細胞。在這個過程中，染色體的濃縮可能與Hp1α蛋白的相分離有密切聯系。Larson和Narlikar發現異染色質具有液滴狀特性，Hp1α蛋白的“相分離”導致異染色質的基因沉默[14,20]，而BuGZ蛋白經歷相變或凝聚以促進紡錘體及其相關組分的組裝[21]。

相分離在蛋白表達過程中也扮演相當重要的角色，影響轉錄和翻譯等過程。首先，相分離可能對轉錄進行調節，Denes等提出了一個基于相分離的模型，解釋了超級增強子高效轉錄的作用原理[22]。核仁是細胞核內重要的RNA/蛋白質的復合體，主要功能為核糖體亞單位的組裝，Brangwynne等的研究表明，大的球形核仁可以通過小的球形核仁的融合形成，表現得像液滴，低復雜性/無序蛋白質基序和重復結合結構域通過促進核質相分離驅動核RNA/蛋白質液滴的組裝[23-24]，Fus主要定位于細胞核，但也存在于細胞質核糖核蛋白 (RNP) 顆粒中，RNA結合蛋白在轉錄、RNA加工和DNA修復中起作用[25-26]。

細胞的穩態調節也有相分離密切參與，在極端狀態時，如低pH的壓力環境下，酵母細胞會啟動保護機制，重要蛋白會聚集成液滴，如蛋白酶體儲存顆粒 (PSG)，其主要由蛋白酶體和游離泛素組成，此外它還在細胞衰老過程中賦予適應性[27]，酵母中類似的蛋白還有聚 (A) 結合蛋白 (Pab1)[28]。酵母中的這種“相分離”狀態的改變也與其休眠有關，當蛋白聚集形成細絲時，似乎允許細胞的代謝下調進入休眠狀態，而ATP依賴的伴侶蛋白則可以使細胞從這種休眠狀態恢復過來[29-30]，類似的還有非洲爪蟾卵母細胞中的巴爾比尼體[31]和秀麗隱桿線蟲的RNP顆粒[32-33]。由“相分離”驅動形成的無膜隔室對衰老相關疾病非常敏感，衰老及相關疾病的發生可能與細胞逐漸失去對細胞內穩態即“相分離”的控制有關[34]。

此外，相分離在DNA修復和信號傳導等重要生命活動中也發揮著重要作用。在有53BP1蛋白參與的DNA損傷修復過程中，53BP1蛋白區存在液滴樣的相分離現象，這種相分離作用可能有助于協調局部DNA損傷識別和全局基因激活[10,35]。在Wnt信號傳導中的細胞質Dv1簇[36-37]以及T細胞活化中的信號傳導簇也是由相分離驅動的[38-39]。

在上述眾多現象中，相分離以其調節相關分子聚集和分散、實現功能活動的分區化發揮重要作用，其過程可由專職的蛋白協調進行。

3 相分離與疾病發生的聯系

鑒于“相分離”參與到細胞的各種生命活動中，其異常的狀態必然會導致多種疾病的發生。

如一些具有朊病毒樣結構域的核RNA結合蛋白，其突變可加速纖維化并引起疾病，包括肌萎縮性側索硬化 (ALS)、額顳葉癡呆 (FTD) 和多系統蛋白病 (MSP)，其中Tdp-43、Fus、EWSER1蛋白從細胞核轉移到細胞質中發生錯誤的定位和聚集，會引起ALS、FTD的發生[40-41]。在MSP中，也發現了hnRNPA1和hnRNPA2的錯誤定位[40,42]。

相分離導致的蛋白沉積可能與多種神經性退行疾病密切相關。Liu和Fang研究發現，PARylation通過影響液-液相分離和淀粉樣蛋白聚集，在多種神經退行性疾病中發揮重要作用[43]。作為老年癡呆的主要疾病，阿爾茨海默病的發生與存在“相分離”現象的Tau蛋白的病變存在很強的相關性。Tau是一種可溶的神經元特異性微管結合蛋白，具有內在無序性和不均勻的電荷分布，當AD中認知缺陷變得明顯時，它們的清除可緩解這種癥狀[44-45]。

長期以來，以“石油精神”為代表的“大慶鐵人精神”，是艱苦奮斗的代名詞，是無私奉獻的精神力量，與“工業學大慶”等口號一路傳承，在我國社會主義建設過程中持續發揮重大引領價值。如今，在國際業務開拓與發展過程中，一大批國企員工走向海外，在海外業務中與國際同行競爭，與合作伙伴共贏，能力素質不斷提升，國際化管理水平不斷增強，以“苦干實干”“三老四嚴”為核心的“石油精神”，在對外傳播時就應該淡化國企色彩，用國際語言傳播“石油精神”，努力做到三個堅守。

另一種破壞性的神經系統疾病——亨廷頓氏病，又稱亨廷頓舞蹈病 (Huntington’s disease，HD)，也與相分離存在聯系。HD的發病與亨廷頓蛋白 (Huntingtin protein，Htt) N-末端區域內的聚谷氨酰胺 (PolyQ) 束的長度有關[46]，即Htt-NTFs。Ramdzan等的研究表明，患者細胞內不溶性內含物可以影響細胞代謝和促進其他蛋白質與Htt-NTFs的共聚集和相分離[47]。Profilin與Htt-NTFs的富含脯氨酸的c38區域的結合通過多相連接降低了聚集和相分離的驅動力[48]。

與上述蛋白類似的還有帕金森病 (Parkinson’s disease) 中的a-突觸核蛋白 (a-synuclein) 等[43]。除此之外，Fus和EWSR1還與癌癥相關，EWSR1常被發現與致癌基因的轉錄相關，朊病毒樣結構域的物理特性可以重新定位關鍵的染色質調節復合物，以建立和維持致癌基因表達程序[49-50]。

4 目前的主要研究方向及研究方法

蛋白能否發生“相分離”可以通過生物信息學方法，根據“相分離”的生物化學特征進行預測，然后再通過實驗手段證明其特性。網站預測和分析蛋白序列是一種預測蛋白是否能發生“相分離”常用的手段，常用的網站如表1所示。

傳統的研究相分離的實驗方法，主要通過體外的液滴形成實驗、凝膠形成實驗、電鏡拍攝原纖維、核磁共振、原纖維衍生、體外相轉變測定、光漂白后的熒光修復 (FRAP) 等。由于IDR介導的蛋白相變在體外可以觀察到明顯的相分離現象，對這類型的蛋白研究更加深入，通過調整緩沖溶液的鹽濃度、pH、溶質成分等可以容易地觀察到相分離，甚至得到蛋白的水凝膠，從而通過染色和拍照等手段進行進一步研究。

盡管在體外實驗中，“相分離”的研究成果已經非常豐富，但仍存在質疑，關鍵在于這種“相分離”現象是否在細胞中實際發生，因此迫切需要有效的檢測平臺，以研究細胞中時刻變化的蛋白的物理狀態[1]。

活細胞成像顯微鏡是細胞內“相分離”研究的基礎，這種顯微鏡可以滿足對活細胞長時間的連續觀察、攝像，捕捉蛋白所形成液滴的動態變化。在此基礎上，需要對觀察的蛋白對象進行良好的標記，以及對細胞狀態的改變刺激。

光遺傳是一種通過光照實時影響細胞內蛋白表達的新方法，已經應用在多個生物研究領域。Shin等通過光遺傳平臺，利用光來激活IDR介導的活細胞相變，構建“opto-Droplet”系統來研究RNP體蛋白的IDR驅動的凝聚相，實現了光控的可逆相分離[51]。Zhu利用Cry2olig光遺傳學系統來調節核仁的粘彈性，發現Cry2olig蛋白質在高于閾值濃度時，核仁可以凝膠化成緊密連接的低遷移率網狀結構[24]?！皁pto-Droplet”系統可以在活細胞內，通過光照改變蛋白表達情況，從而使我們對蛋白相變的實時觀察研究不只停留在簡單的物理、化學條件的改變，還深入到生物大分子對相變的影響[51]。

通過CRISPR技術對細胞內基因進行編輯，在原有蛋白上加入易被追蹤觀察的標志物，可以很好地幫助研究者在不影響該蛋白生理活動的同時，觀察其相變情況。Kilic等通過CRISPR/Cas9工程化內源性的53BP1蛋白基因座并整合編碼小單體紅色熒光蛋白mScarlet的框內序列。在不影響該細胞周期、蛋白表達、應激反應的情況下，利用熒光顯微鏡觀察到了活體細胞中53BP1的液滴狀性質，及頻繁的融合和裂變現象[10]。

隨著新技術不斷被應用到“相分離”研究領域中，我們也能更加深入地了解生物相變的驅動原理及致病原因。

表1 常用網站及其預測方向

5 總結與展望

長久以來，我們對生命探索的關鍵在于分解式的研究，即把宏觀的分解為微觀的，把對個體的研究深入到組織、細胞、分子的層面研究其作用規律，而這種研究往往得到一個點的了解，作為一個復雜而協調的統一體，即便只上升到細胞層面來看，我們所了解的點也構成了一個龐大復雜的集合，各種蛋白如何協調工作，怎樣各司其職而不相互干擾是一直以來困擾研究人員的一個難點。生物相變概念的引入，提供了一個不同蛋白分區工作的思路，或者說同工同時的蛋白與無關蛋白相互分離重組的可行的調度方案。這種新的概念給了我們一個新的研究問題的角度，不僅關注各分子之間的化學作用，并考慮其物理狀態的變化。目前對于相分離的研究主要集中在其發生的生化基礎及特性，相變的化學條件的調控，并向分子相互作用的調控方向發展。其中與疾病相關的可相分離的蛋白更是備受關注，對于相關疾病發生有了新的認識和理解。

隨著相分離研究的深入，由相分離引起的眾多疾病有望找到新的突破口。目前已有一家基于生物相變的生物醫藥公司Dewpoint在美國成立，而PARP抑制劑也有望在神經性退行疾病的治療中發揮新的作用[43]。

生物相變不僅在基礎研究領域給我們帶來新的視角，由于其生物催化活性、可逆縮合和溶解、生長和分裂的特性，液-液相分離在動態細胞合成方面也被認為是一種可行的分區策略[52]。

除此之外，可“相分離”的蛋白在體外表現出的聚集、融合、相變等特性，使其在生物工程領域也具有一定的應用價值和開發前景。生物合成以其環保、可再生以及完成精細復雜產物的優勢，是一種富有潛力的化學合成的替代方案[53]?；谄湟子谡{控以及合成細胞毒性物質等優勢，非細胞生物合成近年來引起重視。但其面臨著酶生產成本高、催化效率低、酶和輔因子的回收等多種問題[54]。而相分離則可能為我們解決體外因酶濃度和聚集程度遠低于細胞內而造成的催化效率低的問題打開了一個新的突破口，目前我們已將相分離應用到非細胞生物合成中，來解決體系穩定性及多酶協同優化等問題。

總而言之，生物大分子的相分離現象一經發現即備受關注，呈現飛速發展的態勢，為細胞研究打開了新的局面，將物理性質與生物領域緊密結合，讓人們以從未有過的物理視角看到了生命活動的神奇。

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Research progress of phase separation of intracellular biological macromolecules

Hui Li1, Qingxi Liu1, Xinjun Li1, Qiang Jiao1,and Wenjian Ma1,2

1,250200,,2,300457,

The phenomenon of phase separation of intracellular biological macromolecules is an emerging research field that has received great attention in recent years. As an aggregation and compartment mechanism of cell biochemical reactions, it widely exists in nature and participates in important physiological processes such as gene transcription and regulation, as well as influences organism’s response to external stimuli. Disequilibrium of phase separation may lead to the occurrence of some major diseases. Researchers in cross-cutting fields are trying to examine dementia and other related diseases from a new perspective of phase separation, exploring its molecular mechanism and the potential possibility of intervention and treatment. This review intends to introduce the latest research progress in this field, summarize the major research directions, biochemical basis, its relationship with disease occurrence, and giving a future perspective of key problems to focus on.

phase separation, biological phase transition, cellular molecule aggregation, disequilibrium of phase separation

10.13345/j.cjb.190466

October 15, 2019;

April8, 2020

Supported by:National Key Research and Development Program (No.2018YFA0901700).

Wenjian Ma. Tel/Fax: +86-22-60602831; E-mail: ma_wj@tust.edu.cn

國家重點研發計劃(No.2018YFA0901700)資助。

2020-05-15

https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20200514.1529.002.html

李惠, 劉慶喜, 李新軍, 等. 細胞內生物大分子的相分離研究進展. 生物工程學報, 2020, 36(7): 1261–1268.

Li H, Liu QX, Li XJ, et al. Research progress of phase separation of intracellular biological macromolecules. Chin J Biotech, 2020, 36(7): 1261–1268.

(本文責編 郝麗芳)