產普魯蘭酶芽孢桿菌L5的ARTP誘變育種及發酵優化研究

宇光海，王翱宇，李海峰，惠 明

河南工業大學 生物工程學院，河南 鄭州 450001

普魯蘭酶(pullulanase)是一類能夠專一性分解α-1,6糖苷鍵的淀粉脫支酶，能產普魯蘭酶的菌種主要有假交替單胞菌(Pseudoalteromonas)、嗜酸芽孢桿菌(Bacillusacidophilus)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)以及少數真菌等[1-4]。在食品工業中，葡萄糖淀粉酶只能水解線性的α-1,4糖苷鍵，而普魯蘭酶可特異性水解支鏈淀粉中的α-1,6糖苷鍵，兩者共同使用可以加快糖化過程并減少葡萄糖淀粉酶的使用量[5]。如今，普魯蘭酶已經成為高效利用淀粉的關鍵酶之一，在果葡糖漿、超高麥芽糖漿以及啤酒生產中起著關鍵作用[6-8]。此外普魯蘭酶在改性淀粉食品生產中也有應用，比如生產抗消化淀粉、緩消化淀粉、歧化環糊精以及直鏈淀粉等[9-11]。然而，普魯蘭酶工業化生產仍面臨單位發酵酶量低、生產成本高等難題，嚴重影響普魯蘭酶的工業化應用[12]。

目前，產普魯蘭酶工業菌株的育種研究主要應用傳統誘變育種及基因工程技術，基因工程育種技術主要包括對產普魯蘭酶野生菌株的直接改造及普魯蘭酶的異源表達。普魯蘭酶異源表達雖有較高的表達量，但容易形成包涵體且復性困難[13]；對產普魯蘭酶野生菌株的直接改造不僅操作復雜而且成本較高[14]；傳統的紫外誘變及化學誘變，不僅正突變率較低而且存在潛在的毒害危險。常壓室溫等離子體(ARTP)誘變技術具有正突變率高、成本低、易操作、安全等優勢，已成功運用于各種產酶微生物育種，如通過采用ARTP對枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)XZI125進行誘變，使納豆激酶活力提高了26.5%[15]；采用ARTP誘變使枯草芽孢桿菌BL03產纖維素酶活力提高了72%[16]；采用ARTP對產葡萄糖氧化酶(GOD)菌株黑曲霉1504進行誘變，產酶活力提高至原始菌株的3.31倍[17]。

作者從鄭州市某淀粉廠附近的土壤中篩選得到一株產普魯蘭酶菌株L5，通過16S rDNA測序、Blast序列對比、構建系統發育樹，鑒定為芽孢桿菌菌屬(Bacillusgenus)。以L5菌株為出發菌株，采用ARTP技術對其進行誘變育種，優化誘變參數，通過3輪誘變篩選出4株普魯蘭酶高產菌株。利用正交試驗對發酵工藝參數進行優化，并對其酶學性質進行初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源

鄭州市某淀粉廠附近的土壤中篩選得到一株產普魯蘭酶菌株L5。

1.1.2 主要試劑

普魯蘭糖：上海瑞永生物科技有限公司；3,5-二硝基水楊酸：國藥集團化學試劑有限公司；基因組提取試劑盒：TaKaRa公司。

1.1.3 培養基

篩選培養基：普魯蘭糖3.0 g，蛋白胨5.0 g，KH2PO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，瓊脂粉20.0 g，加水定容至1 000 mL，pH 7.0。

發酵培養基：可溶性淀粉20 g，蛋白胨10 g，酵母浸粉(或酵母膏)5 g，KH2PO41 g，CaCl21 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，加水定容至1 000 mL，pH 7.0。

1.2 儀器與設備

DHP-9052電熱恒溫培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；TC-XP-G基因擴增儀：杭州博日科技有限公司；ZWYR-D2402恒溫培養振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；T6新世紀紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；MANDELA多功能等離子體誘變儀：北京偉恩斯技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 普魯蘭酶活力測定

采用DNS法[18]測定普魯蘭酶活力。用葡萄糖制作標準曲線，每分鐘生成1 μmol還原糖(以葡萄糖計)所需酶量定義為1個酶活力單位(U)。

1.3.2 16S rDNA鑒定

采用TaKaRa基因組提取試劑盒提取細菌總DNA，利用16S rDNA通用引物(P0∶5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′和P6∶5′-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)，對L5菌株16S rDNA基因進行克隆和測序(賽默飛), 測序結果提交GeneBank數據庫，登錄號為MN148884，并利用MEGA5.1以Neighbor-Joining法構建系統發育樹。

1.3.3 ARTP誘變方法及篩選

以氮氣作為工作氣體(氣流量為12 L/min)，輸入功率115 W，照射距離2 mm，處理時間為10～90 s，間隔為10 s，對L5菌株進行誘變。利用生理鹽水稀釋誘變后菌液，涂布篩選培養基平板，37 ℃避光培養24 h后，挑選水解圈直徑大于對照組的菌株，并轉接到篩選培養基斜面。

1.3.4 正交法優化普魯蘭酶發酵培養基

首先利用單因素試驗初步確定碳源、氮源、金屬離子最佳組合，碳源：可溶性淀粉、支鏈淀粉、糊精、糊精和可溶性淀粉，質量分數為1.0%；氮源：蛋白胨、黃豆粉、酵母浸粉、蛋白胨和黃豆粉、蛋白胨和酵母浸粉、黃豆粉和酵母浸粉，質量分數為1.0%；金屬離子：K+、Ca2+、Mg2+、Fe2+、Zn2+，質量分數為0.1%。然后在單因素試驗的基礎上選定各因素(可溶性淀粉、糊精、蛋白胨、黃豆粉、Ca2+、Fe2+、Zn2+)，進行七因素三水平正交試驗[19]，進一步優化培養基。

1.3.5 生長曲線及產酶曲線測定

平板培養：將菌株接種于篩選培養基上，37 ℃培養24 h。

搖瓶發酵：將菌株以2%的接種量接種到發酵培養基中，37 ℃、180 r/min搖瓶培養24 h，用DNS法測酶活。

生長曲線及產酶曲線測定：將菌株發酵40 h，前12 h間隔2 h取樣，12～48 h間隔4 h取樣，測OD600和所產普魯蘭酶活力。

1.3.6 酶學性質研究

1.3.6.1 普魯蘭酶的最適反應溫度和pH值

在不同溫度(35～85 ℃，間隔為5 ℃)及不同pH值(5.0～8.5，間隔為0.5)條件下，分別測定普魯蘭酶活力，確定酶最適反應溫度及pH 值。

1.3.6.2 普魯蘭酶的溫度及pH穩定性

將酶液分別置于不同溫度(30～80 ℃，間隔為10 ℃)的水浴中保溫2 h后測定酶活力，研究普魯蘭酶的熱穩定性。將酶液分別置于不同pH值(4.0～9.0，間隔為1)的緩沖液中室溫保持4 h后測定酶活力，研究普魯蘭酶的pH穩定性。

1.3.6.3 普魯蘭酶動力學參數測定

在不同質量濃度的普魯蘭糖底物(1～5 mg/mL；溶解于0.2 mol/L、pH 6.5的磷酸緩沖溶液)中加入1 mL酶液，以去離子水為空白對照，測定酶活力，計算出底物不同濃度下酶的反應速度，繪制雙倒數曲線。

2 結果與分析

2.1 菌株的鑒定

將L5的16S rDNA序列進行Blast對比分析，結果表明:L5菌株與芽孢桿菌Bacillussubtilisstrain AB30JX188065.1的相似性超過99%。利用MEGA5.1構建系統發育樹,如圖1所示，菌株L5與Bacillussubtilisstrain AB30JX188065.1、BacillussubtilisIMG04 LC469932.1在同一分支上，表明L5菌株屬于芽孢桿菌菌屬(Bacillusgenus)。

圖1 L5系統發育樹

2.2 ARTP誘變

如圖2所示，致死率隨著誘變時間的延長顯著上升。致死率在60 s時達到79.8%，90 s時趨近100%。誘變時間在30～60 s時正突變率與致死率呈正相關，60 s達到最高(正突變率5.1%)，60 s后正突變率隨誘變時間的延長而顯著下降，表明最佳誘變時間為60 s。

圖2 L5菌株ARTP誘變致死率和正突變率曲線

利用水解圈法挑出218株突變菌進行搖瓶發酵驗證，篩選出發酵產酶活力最高的4株正突變菌株G1(20.33 U/mL)、G2(19.68 U/mL)、G3(19.31 U/mL)、G4(22.01 U/mL)，與出發菌株(10.83 U/mL)相比產酶活力分別提高了87.7%、81.7%、78.3%、103.2%。將普魯蘭酶高產突變菌株G4在斜面固體培養基上進行10次傳代培養，并分別接種發酵培養基，進行產普魯蘭酶發酵穩定性的研究。結果表明，G4具有較好的產普魯蘭酶發酵穩定性，產酶活力波動范圍在5%之內。

2.3 正交法優化菌株產酶條件

2.3.1 單因素試驗

利用單因素試驗初步確定G4菌株發酵培養基最佳的碳源、氮源及金屬離子組合。結果表明，糊精與可溶性淀粉組合為最佳碳源，產酶活力為23.42 U/mL；蛋白胨與黃豆粉組合為最佳氮源，產酶活力為24.39 U/mL；金屬離子中Ca2+、Fe2+、Zn2+對普魯蘭酶活力都有促進作用，與對照組相比，產酶活力分別提高了28.8%、45.1%、48.2%。綜合各單因素結果，確定最佳組合為可溶性淀粉、糊精、蛋白胨、黃豆粉、Ca2+、Fe2+、Zn2+。

2.3.2 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，以可溶性淀粉、糊精、蛋白胨、黃豆粉、Ca2+、Fe2+、Zn2+為因素，設計七因素三水平正交試驗優化普魯蘭酶發酵培養基，結果見表1。

如表1所示，7個因素對G4菌株產普魯蘭酶的影響：可溶性淀粉>Zn2+>Ca2+>糊精>蛋白胨>黃豆粉>Fe2+，并依據k值確定最佳組合為A3B2C1D3E1F2G3，即可溶性淀粉1.5%、糊精1.0%、蛋白胨0.5%、黃豆粉1.5%、Ca2+0.05%、Fe2+0.10%、Zn2+0.15%，產酶活力為27.22 U/mL，比優化前提高了23.7%。由表2可知，在α=0.05條件下，可溶性淀粉、糊精、蛋白胨、Ca2+、Zn2+的F值分別為230.469、72.378、25.643、110.520、156.622，均大于F0.05(19.000)，表明這5個因素對菌株產普魯蘭酶有顯著影響；而黃豆粉和Fe2+的F值分別為9.337、1.000，均小于F0.05(19.000)，表明這兩個因素對菌株產普魯蘭酶影響不顯著。綜上，影響菌株產普魯蘭酶的關鍵因素為可溶性淀粉、糊精、蛋白胨、Ca2+、Zn2+。

表1 正交試驗設計與結果

表2 方差分析

2.4 發酵產酶性能

如圖3所示，2 h后L5菌株和G4菌株均進入指數生長期，G4菌株在12 h后進入穩定期，相比L5菌株提前了4 h；G4菌株在12～40 h(穩定期)的OD600達到9.3～9.6，而L5菌株在16～40 h(穩定期)的OD600為8.1～8.5，小于G4菌株，綜上，在各個生長階段G4菌株均比L5菌株生長旺盛。0～24 h菌株L5的產酶活力隨時間不斷提高，在24 h達到最高值(13.5 U/mL)；G4菌株在0～20 h產酶活力隨著時間不斷上升，在20 h達到最高值(26.9 U/mL)，比L5菌株提前4 h達到最高值，且產普魯蘭酶活力提高了99.3%。綜上，普魯蘭酶的合成屬于初級代謝，與菌體生長呈正相關，因此突變菌株G4旺盛的生長能力是普魯蘭酶高產的重要因素之一。在菌體生長進入穩定期后，普魯蘭酶合成量的減少及本身的降解，導致L5菌株和G4菌株產酶活力下降。

圖3 L5與G4菌株的生長和產酶曲線

2.5 酶學性質研究

2.5.1 酶最適反應溫度與溫度穩定性

如圖4(A)所示，35～50 ℃時G4菌株所產普魯蘭酶活力隨溫度的升高而升高，當溫度超過50 ℃時，酶活力明顯下降，因此該酶的最適反應溫度為50 ℃。隨著溫度的升高，G4菌株所產普魯蘭酶活力不斷下降，在30～60 ℃保溫2 h后相對酶活力仍能維持在80%以上，在70 ℃時還有60%的相對酶活力，說明此菌分泌的普魯蘭酶有良好的熱穩定性。

2.5.2 酶最適反應pH值與pH穩定性

如圖4(B)所示，當pH值小于6.5時，G4菌株所產普魯蘭酶活力隨pH值的增大而增大；當pH值大于6.5時，酶活力隨pH值的增大而減小，由此可判斷該酶的最適反應pH值為6.5。根據普魯蘭酶在食品工業中的實際應用情況，選擇pH 4～9分析酶的pH穩定性[20]，在pH 5～9保存4 h后相對酶活力仍能維持在60%以上，在pH值為4時，相對酶活力為50%左右，表明此菌分泌的普魯蘭酶pH值范圍廣，在酸性和堿性條件下都具有一定的酶活力。

圖4 G4菌株所產普魯蘭酶的酶學特性

2.5.3 酶反應動力學分析

用Lineweaver-Burk雙倒數作圖法，以酶促反應初速度倒數1/v對底物質量濃度倒數1/[S]作圖，如圖5所示。通過回歸方程計算得：1/vmax=0.061，Km/vmax=0.061，vmax=16.393 μmol/min，Km=0.999 mg/mL。Km值較低，表明此酶對普魯蘭糖有強的親和性[21]。

圖 5 酶催化不同濃度普魯蘭糖的Lineweaver-Buk曲線

3 結論

本研究通過16S rDNA序列分析、構建系統發育樹等方法對產普魯蘭酶菌株L5進行了鑒定，確定為芽孢桿菌菌屬(Bacillusgenus)。采用常壓室溫等離子體(ARTP)誘變獲得4株普魯蘭酶高產菌株，其中G4菌株的產酶活力最高(22.01 U/mL)，較出發菌株約提高了2倍，在最優發酵條件下產酶活力達到27.22 U/mL，比優化前提高了23.7%。所產普魯蘭酶的最適反應溫度為50 ℃、最適反應pH值為6.5，30～60 ℃保溫2 h酶活能維持在80%以上，在pH 5～9保存4 h后酶活力仍能維持在60%以上，該酶具有良好穩定性。通過酶動力學試驗驗證，此酶對普魯蘭糖有強的親和性。在大部分食品工業中，中性支鏈淀粉酶應用較廣泛，L5菌所產普魯蘭酶與目前報道的普魯蘭酶相比，反應最適pH值靠近中性，熱穩定性較好，具有潛在的工業應用價值。