3種不同酵母產藍莓酒風味物質的研究

袁文艷，胡佳星，張璐瑤，滿都拉，孫子羽，賈文野，屈 嬡，郭昊翔，趙雪妮，陳忠軍

（內蒙古農業大學食品科學與工程學院，內蒙古呼和浩特 010018）

藍莓（Vaccinium citisidaea）為杜鵑花科越橘屬，表皮外披白霜，果肉酸甜可口，風味獨特；因富含各種營養成分被譽為——“漿果之王”[1]，其果實中的營養成分主要有花青素（其花青素含量是所有水果中最高的[2]）、類黃酮、超氧化物歧化酶等化合物。這些豐富的營養成分使其具有很好的保健功能，還因此被聯合國糧農組織列為世界五大健康食品之一[3-7]。由于藍莓果實柔軟多汁，易破碎、腐爛，導致其保鮮難度和保鮮成本較高，因此提倡以加工為主對其進行綜合利用。果酒是以水果為原料，釀造得到的低度酒精飲料；除含有乙醇外，還富含機體所需多種微量營養素、糖、有機酸等物質，因而具有一定的保健功能[8]。藍莓酒作為藍莓的一種加工產品，既在一定程度上保留了藍莓的營養、風味，又融合了果酒的營養保健功效，符合現在社會人們的飲食生活習慣及對健康生活的追求。

藍莓酒的風味主要依賴于酒中所含的糖、單寧和酸類物質[9]，藍莓本身的風味及其在發酵過程中所呈現的獨特的香氣成分也是藍莓酒風味物質的重要組成部分。風味物質的種類、濃度及其融合度直接決定了藍莓酒口感的協調性、復雜性和典型性[10]。此外，不同酵母菌株的最適條件、發酵性能的差異對藍莓酒的風味物質也有影響。因此，本實驗采用氣相色譜法和液相色譜法對不同酵母菌株發酵的藍莓酒的風味物質進行探究[11-13]，并以電子舌對藍莓酒進行感官分析[14-16]，為藍莓酒的研究及開發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生藍莓鮮果（鮮果總糖12.46%，總酸2.37 g/kg）：內蒙古根河野生資源開發公司；產酯酵母菌T1、耐酸酵母菌FK3-2、耐糖酵母菌LM6：本實驗室篩選保藏；偏重亞硫酸：天津化學試劑三廠；白酒混合標樣-15組分（色譜純）：蘭州東立龍信息技術有限公司；甲醇（分析純）：天津市鼎盛鑫化工有限公司。

1.2 儀器與設備

美嘉寶A-103多功能榨汁攪拌機：購于華聯超市；FA2104N電子分析天平：奧豪斯儀器上海有限公司；PHS-3C pH計：上海儀電科學儀器股份有限公司；PAL-1糖度儀：日本TOKOY ATAGO公司；GC-7900氣相色譜（gas chromatography，GC）分析儀：上海天美科學儀器有限公司；G7129A高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）分析儀：新加坡安捷倫科技；SA402B電子舌：北京盈盛恒泰科技有限責任公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 藍莓酒發酵及檢測

將酵母菌分別接種于滅菌的酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養基中進行活化。將活化的T1、FK3-2和LM6菌液以3%接種量接種于藍莓與水1∶1的藍莓汁中，添加偏重亞硫酸鉀240 mg/L、白砂糖（使初始糖度達到32.2°Bx）等進行成分調整，并將藍莓醪液的pH調至3.8。在28 ℃培養箱中恒溫發酵，分別在主發酵7 d、14 d、21 d及28 d取樣進行氣相色譜、液相色譜及電子舌檢測。為保持成品酒口感，至殘糖8.0°Bx后終止發酵，將藍莓酒過濾除菌，于14 ℃培養箱中靜置。

1.3.2 樣品的制備

氣相色譜標樣的配制：標樣為白酒混合標樣15組分，包括乙醛、甲醇、乙醇、正丙醇、乙酸乙酯、仲丁醇、異丁醇、乙縮醛、正丁醇、異戊醇、丁酸乙酯、乙酸正丁酯、乳酸乙酯、戊酸乙酯、正己醇；內標物：乙酸正丁酯（0.173 4 mg/mL）。

液相色譜標準溶液的配制：分別配制質量濃度為0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0 mg/mL、3.0 mg/mL、4.0 mg/mL的草酸溶液，質量濃度為1.0 mg/mL、2.0 mg/mL、4.0 mg/mL、6.0 mg/mL、8.0 mg/mL的酒石酸溶液、DL-蘋果酸溶液、α-酮戊二酸溶液、乳酸溶液、冰乙酸溶液、檸檬酸溶液、L-焦谷氨酸溶液、琥珀酸溶液，混合標準溶液濃度為2.0 mg/mL，超聲波脫氣20 min。

氣相色譜法檢測樣品的處理：取樣品20 mL蒸餾，蒸餾至餾出液10 mL，將餾出液用0.22 μm級的濾膜過濾，取1 mL過濾后的餾出液與10 μL內標液混勻。

液相色譜法檢測樣品的處理：稱取10 mL藍莓酒，加適量活性炭后用玻璃棒攪拌1min，攪拌均勻后靜置10～20min。將靜置后的酒液抽濾，通過0.22 μm的濾頭過濾后裝入進樣瓶備用。

電子舌檢測樣品的處理：將發酵結束的藍莓酒使用雙層紗布過濾后倒入電子舌檢測專用杯，酒液倒至內緣分界線上端1～3 mm處。

1.3.3 色譜條件

氣相色譜條件：色譜柱為LZP-930（30 m×0.32 mm，1.0 μm）；柱溫初始溫度50 ℃保持6 min，再以8 ℃/min升溫至170 ℃，保持8 min；氫火焰離子化檢測器（flame ionization detector，FID）；進樣口溫度220 ℃；檢測器溫度230 ℃；載氣為氮氣；進樣量為1 μL。采用內標法定量分析。通過計算待測組分與內標物峰面積的比值，獲得待測樣品香氣成分的含量。

高效液相色譜條件：色譜柱為Poroshell 120 EC-C18（150 mm×4.6 mm，4 μm）；柱溫40 ℃；流動相為100%的0.01 mol/L磷酸二氫鉀水溶液[17]（磷酸調至pH 2.9）；流速0.30 mL/min；紫外檢測波長210 nm；進樣量10 μL。

2 結果與分析

2.1 不同酵母發酵藍莓酒揮發性物質含量比較

對3種酵母發酵藍莓酒分別在主發酵7 d、14 d、21 d及28 d取樣進行15種揮發性物質分析結果見表1～表3。

表1 FK3-2酵母發酵藍莓酒15種揮發性物質含量測定結果Table 1 Determination results of 15 kinds of volatile substances in blueberry wine fermented by yeast FK3-2

由表1可以看出，FK3-2酵母發酵的藍莓酒在發酵7 d、14 d及28 d時均可檢測到12種揮發性物質，但在發酵21 d時僅檢測到9種。在發酵7 d、14 d和21 d時，正丙醇、異丁醇、異戊醇、乙酸乙酯及正丁醇含量含量較低，發酵28 d時明顯增加，這可能是FK3-2酵母菌活力激發需要較長時間的緣故。

表2 LM6酵母發酵藍莓酒15種揮發性物質含量測定結果Table 2 Determination results of 15 kinds of volatile substances in blueberry wine fermented by yeast LM6

由表2可以看出，LM6酵母發酵的藍莓酒發酵7 d時檢測到8種揮發性物質，發酵14 d時檢測到13種，發酵21 d時檢測到10種，28 d時可檢測到11種?？梢奓M6酵母菌產生的揮發性物質種類整體呈上升趨勢，其中正丙醇、異丁醇、異戊醇、丁酸乙酯、戊酸乙酯、正丁醇及仲丁醇含量在發酵28 d時分別為0.475 1 mg/mL、2.377 3 mg/mL、2.131 4 mg/mL、2.0533mg/mL、0.8548mg/mL、0.0420mg/mL、0.3678mg/mL。

表3 T1酵母發酵藍莓酒15種揮發性物質含量測定結果Table 3 Determination results of 15 kinds of volatile substances in blueberry wine fermented by yeast T1

由表3可以看出，T1酵母發酵的藍莓酒發酵7 d時可檢測到11種揮發性物質，發酵14 d時可檢測到12種，發酵21 d時僅可檢測到7種，28 d時可檢測到12種。正丙醇、異戊醇、丁酸乙酯、乳酸乙酯、戊酸乙酯及正丁醇含量在發酵28 d時增加至0.053 9 mg/mL、1.243 1 mg/mL、1.376 3 mg/mL、0.069 3 mg/mL、0.285 5 mg/mL、0.263 7 mg/mL。

酯類化合物具有花、果的香味[18]，是果酒香型的特征性成分，可以使酒體柔和、酒香綿長[19-20]。綜合表1～表3可知，3種酵母發酵藍莓酒的正丙醇和異戊醇含量均明顯增加。發酵28 d時，LM6酵母發酵藍莓酒中正丙醇和丁酸乙酯含量高于另外兩種藍莓酒，FK3-2酵母發酵藍莓酒的異戊醇含量高于另外兩種藍莓酒。而且FK3-2酵母發酵藍莓酒中正丙醇、丁酸乙酯、正丁醇及異丁醇含量較高；LM6酵母發酵藍莓酒和T1酵母發酵藍莓酒均是正丙醇和丁酸乙酯含量較高。這些醇類化合物主要來源于酵母菌的代謝、氨基酸分解轉化等，其中的高級醇不但可以賦予酒優雅的香氣，還為其他香味物質提供了良好溶劑，對酒的香型起著重要作用。

2.2 不同酵母發酵藍莓酒有機酸含量比較

對3種酵母發酵藍莓酒分別在主發酵7 d、14 d、21 d及28 d取樣進行有機酸含量分析，結果見表4～表6。

表4 FK3-2酵母發酵藍莓酒有機酸的含量檢測結果Table 4 Determination results of organic acid contents in blueberry wine fermented by yeast FK3-2

表5 LM6酵母發酵藍莓酒有機酸的含量檢測結果Table 5 Determination results of organic acid contents in blueberry wine fermented by yeast LM6

表6 T1酵母發酵藍莓酒有機酸的含量檢測結果Table 6 Determination results of organic acid contents in blueberry wine fermented by yeast T1

由表4可知，FK3-2酵母發酵的藍莓酒發酵7 d、14 d時檢測到10種有機酸，發酵21 d和28 d時檢測到9種有機酸。隨著發酵時間的延長，所含酸的種類有所減少，L-蘋果酸及琥珀酸含量在發酵28 d時分別降至0.1028 mg/mL、0.382 6mg/mL，檸檬酸含量分別由0.619 2 mg/mL和0.766 1 mg/mL降為0，而草酸含量由1.399 2 mg/mL增至2.620 4 mg/mL。

由表5可知，LM6藍莓酒發酵7 d及14 d時可檢測到10種有機酸，發酵21 d和28 d時可檢測到9種。隨著發酵時間的延長，所含酸的種類有所減少，檸檬酸含量由1.188 6 mg/mL逐漸降為0，草酸含量由2.9853mg/mL增至3.1702mg/mL，L-蘋果酸、乳酸及琥珀酸含量降至0.089 5 mg/mL、9.871 5 mg/mL、3.061 2 mg/mL。

由表6可知，T1藍莓酒發酵7 d、21 d及28 d檢測到9種有機酸，14 d時檢測到10種有機酸。隨著發酵時間的延長，琥珀酸含量由0.444 8 mg/mL降為0.278 6 mg/mL，檸檬酸含量由0.014 9 mg/mL降為0，而α-酮戊二酸、焦谷氨酸及乳酸含量增至0.233 3 mg/mL、0.029 3 mg/mL、3.368 2 mg/mL。D-蘋果酸和L-蘋果酸在14 d及21 d時含量有明顯增加，增至2.632 8 mg/mL及1.890 5 mg/mL和0.482 8 mg/mL及0.321 4 mg/mL但在28 d時又大幅下降為0.089 4 mg/mL和0.030 7 mg/mL。

綜合可知，發酵過程中3種酵母發酵的藍莓酒檸檬酸含量逐漸下降，可能是在發酵過程中被微生物消耗或作為底物被利用。T1藍莓酒中α-酮戊二酸、焦谷氨酸及乳酸含量增多；LM6及FK3-2藍莓酒中草酸含量增加，L-蘋果酸、乳酸及琥珀酸含量下降。有機酸有助于提高果酒的利口性，使酒體清爽[19]。這些有機酸一部分如蘋果酸、檸檬酸、酒石酸等來自藍莓果實本身，一部分如乳酸、琥珀酸等是發酵過程中微生物代謝產物，因此酸的含量的升降反映的是酵母菌的特性，該變化與揮發也有一定的關系。通過比較可知T1酵母菌產生的酸的種類略多，增加了口感的復雜性。

2.3 電子舌圖譜分析

利用電子舌數據分析系統（SA402B）對發酵7 d、14 d、21 d及28 d的三種藍莓酒進行分析，將其響應值作雷達圖，結果見圖1。

圖1 3種不同酵母發酵藍莓酒主發酵7 d（A）、14 d（B）、21 d（C）、28 d（D）的電子舌分析數據雷達圖Fig.1 Electronic tongue analysis of blueberry wine by three different yeasts at main fermentation for 7 d(A),14 d(B),21 d(C)and 28 d (D)

由圖1可知，發酵7 d時，3種不同酵母發酵藍莓酒味感相似，且T1與FK3-2幾乎重合。三者均是咸味突出，鮮味較強，回味B和豐富性也強于其他味感，甜味不明顯。發酵14 d時，三者澀味強于剩余味感，LM6藍莓酒澀味最明顯，T1藍莓酒回味B比其他9種味感更明顯。發酵21 d及28 d時，FK3-2藍莓酒和T1藍莓酒的雷達圖幾乎重合，皆是酸味突出，澀味較其他味感更明顯。發酵21 d時LM6藍莓酒10種味感較均衡，咸味、鮮味、豐富性略強于其他味感，但在發酵28 d時，LM6藍莓酒的酸味變得突出。

FK3-2和T1酵母發酵藍莓酒的味感在主發酵期基本上十分接近，表明兩種酵母菌在發酵時產生的風味物質組合之間的相互作用能產生相似的味道，使人品嘗時難以分辨，二者可相互替代；LM6酵母菌所產藍莓酒的味感在發酵中趨于均衡但咸味、鮮味、豐富性更為突出，使果酒口感復雜柔和恰到好處。但在發酵28 d，該酒的酸味大大增強，可能是產生雜菌，使用時應注意避免染菌。

3 結論

通過氣相色譜法、高效液相色譜法及電子舌檢測發現不同的酵母菌株對藍莓酒的揮發性物質含量、有機酸含量及咸味、回味、鮮味、豐富性等味感有不同程度的影響。

使用氣相色譜法檢測發現酵母菌LM6與酵母菌T1產醇類和酯類較多，形成的風味更為復雜。

使用高效液相色譜法檢測發現T1酵母菌產生有機酸的能力略強于FK3-2和LM6。LM6和FK3-2酵母菌產有機酸性能相似，隨著發酵時間的延長，皆是草酸含量增加，L-蘋果酸、乳酸及琥珀酸含量下降。

使用電子舌檢測發現FK3-2和T1酵母菌產生的滋味基本一致，酸味明顯；LM6酵母菌產生的鮮味、咸味及豐富性3種味感更明顯，且在28 d時酸味大大增強。

酵母菌T1生產的藍莓酒氣味和利口性較好，酵母菌LM6生產的藍莓酒氣味和口感的復雜性較好，兩者在香氣、口感方面優于酵母菌FK3-2。酵母菌LM6生產的藍莓酒更加馥郁可口。