芝麻粕蛋白酶法提取工藝優化及組分分析

皮詩宇，王常高，杜 馨，蔡 俊

（湖北工業大學發酵工程教育部重點實驗室工業微生物湖北省重點實驗室工業發酵湖北省協同創新中心，湖北武漢 430068）

芝麻（Sesamum indicumL.）是一種被廣泛利用的油料種子作物，屬胡麻科（Pedaliaceae）胡麻屬（Sesamum），是胡麻的籽種，我國四大食用油料作物之一[1-2]。芝麻提油后的副產物稱為芝麻粕，其中含有豐富的蛋白質[3]。芝麻粕中蛋白質平均含量為42.5%～47.9%[4]，營養價值較高，具有良好的乳化性、乳化穩定性、吸油性、起泡性及泡沫穩定性等功能特性[5-6]。但芝麻在利用傳統方法提油后，得到的芝麻粕蛋白變性嚴重，并且殘留的油脂和纖維素形成物理屏障作用造成芝麻粕蛋白利用困難[7]，一直被作為劣質飼料或廢物，造成資源的浪費。

當今日益增長的食物資源供給需求矛盾，開發新的蛋白質資源并合理利用迫在眉睫，尤其是植物性蛋白資源的開發利用已成為世界各國解決食物資源匱乏的重要途徑?；ㄉ鞍?、玉米蛋白和大豆蛋白已經普遍應用于市場中，但對芝麻粕蛋白的利用還沒有引起足夠的重視[8]。目前，芝麻粕蛋白的提取方法[9-11]對其提取率影響較大，生物法提取的芝麻粕蛋白含量較高[12-13]，但植物蛋白結構復雜，相對分子質量較大，不易于人體的消化吸收；通過酶解制備蛋白多肽有利于人體的吸收，并具有抗氧化、降血壓、提高機體免疫力的生理功能[14]。近年來研究發現，表面活性劑與蛋白質同時存在時可以競爭吸附蛋白質，使乳狀液不穩定，繼而過濾除油[15-16]。同時，表面活性劑能降低酶解過程木質素對酶的非特異性吸附，從而提高酶解效率[17]。

本研究以芝麻粕為原料，采用表面活性劑吸附油脂法對芝麻粕進行脫脂預處理，并結合水劑法去除表面活性劑，得到蛋白質含量較高的芝麻粕。但蛋白質的分子質量較大，不利于其在醫藥、食品等方面的應用，因此，選取最佳蛋白酶對芝麻粕蛋白進行水解，并利用單因素輪換法和正交試驗提高芝麻粕蛋白溶出率，確定最佳酶解條件。最后，利用2,4-二硝基氟苯柱前衍生高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法分析水解產物中氨基酸的含量及組成，以期為后續開發利用芝麻粕提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

芝麻粕：市售；堿性蛋白酶（10萬U/g）、中性蛋白酶（10萬U/g）：諾維信生物技術有限公司；木瓜蛋白酶（80萬U/g）：南寧龐博生物工程有限公司；吐溫80、十二烷基硫酸鈉、石油醚（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；硬脂酸（分析純）：上海三消化工有限公司；氨基酸標準品：武漢市華順生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

KDN-12C消化爐、KDN-1000全自動定氮儀：上海昕瑞儀器儀表有限公司；FD-2型真空冷凍干燥機：北京博醫康實驗儀器有限公司；DD5M型低速大容量多管架離心機：長沙平凡儀器有限公司；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：河南省予華儀器有限公司；LC-20AD型高效液相色譜儀：日本SHINADZU公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 芝麻粕主要成分分析

灰分含量：參照GB5009.4—2016《食品安全國家標準食品中灰分的測定》測定[18]；粗纖維含量：參照GB/T 5009.10—2003《植物類食品中粗纖維的測定》測定[19]；還原糖含量：參照GB 5009.7—2016《食品安全國家標準食品中還原糖的測定》測定[20]；脂肪含量：參照GB5009.6—2016《食品安全國家標準食品中脂肪的測定》測定[21]；總蛋白含量：參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》測定[22]；水分含量：參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標準食品中水分的測定》測定[23]。

1.3.2 芝麻粕脫脂處理[24-27]

選用硬脂酸、十二烷基硫酸鈉和吐溫80作為芝麻粕脫脂預處理所用脫脂劑，反應結束后利用水劑法去除溶液中的脫脂劑，得到蛋白含量較純的芝麻粕。

稱取一定量的未脫脂芝麻粕，測定粗脂肪含量（m1）。稱取3份未脫脂芝麻粕5.00 g，粉碎，加入100 mL蒸餾水，分別加入1%的吐溫80、十二烷基硫酸鈉、硬脂酸，在50 ℃磁力攪拌水浴鍋中恒溫加熱，浸提時間30 min。脫脂反應結束后在4 000 r/min條件下離心15 min，棄上清，沉淀用蒸餾水洗3次，置于烘箱中烘干。取出一定量的脫脂芝麻粕，測定脫脂后樣品中的脂肪含量（m2）及蛋白含量，計算3種表面活性劑處理芝麻粕的脫脂率，比較吐溫80、十二烷基硫酸鈉、硬脂酸的脫脂效果，選擇脫脂效果最好的表面活性劑作為芝麻粕脫脂劑。

脫脂率計算公式如下：

1.3.3 芝麻粕蛋白水解酶的選擇

稱取3份脫脂芝麻粕樣品10 g，按料液比1∶4（g∶mL）加入蒸餾水制備懸濁液，分別加入脫脂芝麻粕質量的0.01%的中性蛋白酶、堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶。按各酶的適宜pH值、溫度水解5 h后，8 000 r/min離心15 min，取上清液，采用凱氏定氮法[22]測定可溶性蛋白含量，計算芝麻粕蛋白溶出率，選擇最優芝麻粕蛋白水解酶。蛋白質溶出率計算公式如下：

1.3.4 芝麻粕蛋白酶解條件優化單因素試驗

選取最優水解蛋白酶，確定蛋白酶的初始水解條件為料水比1∶8（g∶mL），酶解時間5 h，酶解溫度40 ℃，加酶量0.01%。在此基礎上，采用單因素輪換法依次考察酶解時間為（1 h、2 h、3 h、4 h、5 h）、料水比（1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12）、酶解溫度（30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃）及加酶量（0、0.01%、0.02%、0.03%、0.04%）對芝麻粕蛋白溶出率的影響，確定最適酶解條件。

1.3.5 芝麻粕蛋白酶解條件優化正交試驗

在單因素試驗的基礎上，以酶解溫度（A）、酶解時間（B）、料水比（C）、加酶量（D）為考察因素，蛋白質溶出率（Y）為評價指標，選擇L9（34）正交表進行4因素3水平正交試驗優化，試驗因素與水平見表1。

表1 堿性蛋白酶水解芝麻粕蛋白條件優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for hydrolysis conditions optimization of protein from sesame meal by alkaline protease

1.3.6 芝麻粕蛋白水解物組成成分分析

采用2,4-二硝基氟苯柱前衍生高效液相色譜法檢測芝麻粕蛋白水解物中的游離氨基酸[28]。

檢測條件：流動相A為0.04 mol/L無水乙酸鈉溶液，流動相B為體積分數為50%的乙腈水溶液，檢測波長為360 nm，流速為1 mL/min，色譜柱為C18VP-ODS（5 μm，250 mm×4.6 mm），梯度洗脫：0～20 min，70%A；20～26 min，64%A；26～41 min，45%A；41～46 min，35%A；46～48 min，10%A；48～54 min，2%A；54～60 min，30%A。

根據保留時間定性，采用外標法定量。

1.3.7 數據處理

采用SPSS 20.0軟件設計正交試驗方案，采用Excel 2013版軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 芝麻粕原料的主要成分分析

芝麻粕原料的主要成分見表2。

表2 芝麻粕的主要成分Table 2 Main components of sesame meal

由表2可知，芝麻粕中灰分和粗纖維含量較高，分別為14.05%和17.11%。植物纖維素可作為一種可再生原料，被再加工成甜味素等功能材料[29]；灰分含量較高表明芝麻粕中礦物質元素豐富，含有的礦物元素中鐵含量豐富[30]，可用于人體的生長發育。由此可知，芝麻粕有很好的利用價值。芝麻粕中粗蛋白含量最高（42.21%），較豆粕中蛋白質含量高9%[31]，較棉籽餅粕中蛋白含量高5%[32]，可作為蛋白質資源利用。但芝麻粕中含有3.98%的脂肪，該脂肪是芝麻在榨油后殘留的，油相將芝麻粕蛋白包裹也是造成芝麻粕蛋白提取困難的原因之一。因此，本試驗針對芝麻粕進行脫脂預處理，提高芝麻粕蛋白提取率。

2.2 3種表面活性劑脫脂效果的比較

芝麻粕是芝麻壓榨生產油料后的廢棄物，其中殘留部分油脂，如果酶解產物含有較多的脂肪會造成其在溫度較高時容易焦化，并對氮含量的測定結果有一定的影響。因此，先將芝麻粕脫脂，脫脂后利用水劑法[27]除去脫脂劑，得到蛋白質含量較純的芝麻粕。比較3種表面活性劑對芝麻粕脫脂率的影響，結果見表3。

表3 3種表面活性劑對芝麻粕脫脂率的比較Table 3 Comparison on degreasing rates of 3 surfactants on sesame meal

由表3可知，吐溫80的脫脂效果最好，脫脂率達93.49%；其次是十二烷基硫酸鈉，脫脂率為92.39%；硬脂酸的脫脂率僅為51.51%。脫脂后得到的芝麻粕蛋白含量與表面活性劑性能有關，使用吐溫80脫脂后，芝麻粕蛋白質含量提高7.31%。吐溫80作為非離子型表面活性劑與陰離子型表面活性劑相比，穩定性高，具有高表面活性、水溶液的表面張力低、臨界膠束濃度低、膠束聚集數大、增溶作用強以及良好的乳化力和去污力，是提高芝麻粕蛋白質含量的主要原因[26]。因此，選用脫脂效果最好的吐溫80作為芝麻粕的脫脂劑。

2.3 芝麻粕蛋白水解酶的選擇

不同蛋白酶對芝麻粕蛋白的酶解效果見表4。

表4 不同蛋白酶對芝麻粕蛋白的酶解效果比較Table 4 Comparison of enzymatic hydrolysis effects of different proteases on protein from sesame meal

由表4可知，堿性蛋白酶對芝麻粕蛋白酶解后的芝麻粕蛋白溶出率最高，為72.61%，其次為木瓜蛋白酶（70.23%），中性蛋白酶最差（66.62%）。分析原因可能是芝麻粕蛋白在堿性溶液中的溶解度較大[13]，酶能充分與蛋白接觸進行酶解。因此，選定堿性蛋白酶最佳。

2.4 堿性蛋白酶酶解芝麻粕蛋白條件優化單因素試驗

2.4.1 酶解時間對芝麻粕蛋白溶出率的影響

酶解時間對芝麻粕蛋白溶出率的影響見圖1。

圖1 酶解時間對芝麻粕蛋白溶出率的影響Fig.1 Effect of enzymatic hydrolysis time on the dissolution rate of protein from sesame meal

由圖1可知，隨著酶解時間的增加，芝麻粕蛋白溶出率也隨之增加，當酶解時間為4 h時，芝麻粕蛋白溶出率最高并趨于穩定，為70.25%。酶解時間過短會造成芝麻粕蛋白無法完全酶解，導致芝麻粕蛋白溶出率不高；當芝麻粕蛋白酶解完畢后酶解過程將終止，酶解時間過長會降低生產效率。因此，確定芝麻粕蛋白的最佳酶解時間為4 h。

2.4.2 料水比對芝麻粕蛋白溶出率的影響

料水比對芝麻粕蛋白溶出率的影響見圖2。

由圖2可知，隨著料水比的減小，芝麻粕蛋白溶出率隨之增加，當料水比達到1∶10（g∶mL）時，芝麻粕蛋白溶出率達到最高，為71.21%。料水比較大時，堿性蛋白酶與芝麻粕蛋白沒有足夠的接觸面積，影響芝麻粕蛋白溶出率；當料水比達到1∶10（g∶mL）后，此時的料水接觸面積達到飽和，進一步減小料水比并不會導致芝麻粕蛋白溶出率增大，反而會增加工藝成本。因此，確定料水比為1∶10（g∶mL）。

圖2 料水比對芝麻粕蛋白溶出率的影響Fig.2 Effect of material to liquid ratio on the dissolution rate of protein from sesame meal

2.4.3 酶解溫度對芝麻粕蛋白溶出率的影響

酶解溫度對芝麻粕蛋白溶出率的影響見圖3。由圖3可知，隨著酶解反應溫度的升高，芝麻粕蛋白溶出率呈現先上升后下降的趨勢，當酶解溫度達到50 ℃時，芝麻粕蛋白溶出率達到最大，為79.20%。這主要是因為堿性蛋白酶的酶活受溫度影響，在最適溫度范圍內，酶活隨溫度的升高而增大，超過酶活最適溫度時，酶活隨溫度的升高而降低。因此，確定芝麻粕蛋白的最佳酶解溫度為50 ℃。

圖3 酶解溫度對芝麻粕蛋白溶出率的影響Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on the dissolution rate of protein from sesame meal

2.4.4 加酶量對芝麻粕蛋白溶出率的影響

加酶量對芝麻粕蛋白溶出率的影響見圖4。由圖4可知，隨著加酶量的增加，芝麻粕蛋白溶出率隨之增加，當加酶量為0.03%時，芝麻粕蛋白溶出率達到最大，為87.61%。確定酶解底物濃度后，增加酶量會使芝麻粕蛋白溶出率提高，當底物消耗完畢反應終止，繼續增加酶量不會提高芝麻粕蛋白溶出率，并且會造成資源浪費。因此，確定加酶量為0.03%。

圖4 加酶量對芝麻粕蛋白溶出率的影響Fig.4 Effect of enzyme addition on the dissolution rate of protein from sesame meal

2.5 堿性蛋白酶酶解芝麻粕蛋白條件優化正交試驗

在單因素試驗的基礎上，以酶解溫度（A）、酶解時間（B）、料水比（C）、加酶量（D）為考察因素，以芝麻粕蛋白溶出率（Y）為考察指標，進行4因素3水平正交試驗，結果與分析見表5，方差分析結果見表6。

表5 堿性蛋白酶水解芝麻粕蛋白條件優化正交試驗結果與分析Table 5 Results and analysis of orthogonal tests for hydrolysis conditions optimization of protein from sesame meal by alkaline protease

表6 正交試驗結果方差分析Table 6 Variance analysis of orthogonal tests results

由表5及表6可知，各因素對芝麻粕蛋白溶出率影響的主次順序為B＞A＞C＞D，即酶解時間＞酶解溫度＞料水比＞加酶量，根據F比和P值可知，酶解溫度、酶解時間和料水比的影響較為顯著。最優水平組合為A2B1C2D3，即酶解溫度50 ℃、酶解時間3 h、料水比1∶10（g∶mL）、加酶量0.04%，與試驗組最優組合一致，在此條件下芝麻粕蛋白溶出率可達88.94%。與僅利用蛋白酶直接酶解芝麻粕對比[33]，利用表面活性劑預處理后，再使用堿性蛋白酶酶解法得到的芝麻粕蛋白溶出率提高18.58%；并且吐溫80作為表面活性劑價格低廉，能在今后的工業化中起到較好的作用。

2.6 芝麻粕蛋白水解物組成成分分析

2.6.1 芝麻粕蛋白水解物中氨基酸組成分析

芝麻粕蛋白水解物中氨基酸的組成及含量見表7。

表7 芝麻粕蛋白水解物的氨基酸組成與含量Table 7 Composition and contents of amino acid in protein from sesame meal hydrolysate

由表7可知，芝麻粕蛋白水解物中含有20種氨基酸，8種人體必需氨基酸。其中酪氨酸含量（33.01 g/100 g）最高，占總氨基酸含量的21.65%，酪氨酸可用作氨基酸類藥、營養增補劑等工業生產；其次是半胱氨酸和甲硫氨酸，約占總氨基酸含量的13%～14%，其中半胱氨酸可用于面包、天然果汁中防止食品老化；甲硫氨酸是氨基酸輸液和綜合氨基酸制劑的主要組成之一[34]，價格低廉。但本試驗與SINGH K K等[35]的研究結果相比，賴氨酸和谷氨酸含量較低，酪氨酸和甲硫氨酸含量較高，分析原因可能是由于芝麻生長環境、遺傳等其他不可控因素造成的。

2.6.2 芝麻粕蛋白水解物中必需氨基酸組成分析

芝麻粕蛋白水解物與不同種類蛋白質成分中人體必需氨基酸組成及聯合國糧農組織（food and agriculture organization of the united nations，FAO）/世界衛生組織（world health organization，WHO）推薦值的對比與分析見表8。

由表8可知，芝麻粕蛋白水解物中人體必需氨基酸占總氨基酸的質量分數基本高于菜籽粕分離蛋白和花生餅粕分離蛋白的質量分數，其中甲硫氨酸＋半胱氨酸的含量最高，占總氨基酸含量的28.3%，明顯高于FAO/WHO的推薦值（3.5%）；纈氨酸和異亮氨酸含量均高于其他兩種分離蛋白氨基酸含量，纈氨酸和異亮氨酸等支鏈氨基酸的注射液能治療肝功能衰竭以及器官損傷；但蘇氨酸含量低于其他兩種蛋白氨基酸含量，且含量低于FAO/WHO推薦值（4.0%），因此，芝麻粕蛋白水解物不能應用于制備有關蘇氨酸的產品。綜上所述，芝麻粕蛋白水解物中含有的人體必需氨基酸從營養均衡的角度來看，對人體的營養價值較高，可以作為食品添加劑應用于食品行業。

表8 不同種類蛋白質成分中必需氨基酸組成對比Table 8 Comparison of essential amino acid composition in different protein components

3 結論

吐溫80的脫脂效果最好，脫脂率達到93.49%，脫脂后芝麻粕蛋白含量為（49.00±0.37）%，較未脫脂蛋白含量提高7.31%。堿性蛋白酶為水解芝麻粕蛋白的最佳蛋白酶，其最佳酶解條件為酶解溫度50 ℃、酶解時間3.0 h、料水比1∶10（g∶mL）、加酶量0.04%，芝麻粕蛋白溶出率為88.94%。從脫脂后芝麻粕蛋白水解物中共檢測到20種氨基酸，其中含有8種人體必需氨基酸的含量高于FAO/WHO的推薦值。