青海亞麻籽總酚含量測定及其抗氧化活性研究

王興瑞，陳昀昀，韓玉澤，李應霞，王進英,2

(1.青海大學 農牧學院，西寧 810016； 2.青海大學 三江源生態與高原農牧業國家重點實驗室，西寧810016)

亞麻(LinumusitatissimumL.)是亞麻科、亞麻屬的一年生草本植物，可分為纖維用亞麻、油用亞麻和油纖兼用亞麻3種類型。亞麻是世界十大油料作物之一，居世界油料總產量第7位[1]。亞麻是我國的重要經濟作物，主要分布在西北和華北北部的干旱、半干旱高寒冷涼地區[2-3]。其中，青海亞麻種植歷史悠久，青海特有的高原地理和氣候特征使得青海亞麻成為了一種具有栽培價值的油料作物，在青海亞麻俗稱胡麻[4]。

亞麻籽含脂肪30%～41%、纖維素20%～35%、蛋白質20%～30%、水分4%～8%、灰分3%～4%和單糖1%[5]。除此之外，亞麻籽中還含有一定的微量組分，包括生氰糖苷、植酸、酚類物質、胰蛋白酶抑制劑、谷酰胺脯氨酸、木脂素、礦物質、維生素等[6]。研究[7-8]發現，酚類化合物具有抗氧化、抗癌、抗炎等功效，能有效預防高血脂、高血糖、心腦血管疾病、腫瘤等慢性疾病。

亞麻籽中酚類物質的含量水平與基因或品種、收獲時間、產地與環境有關[9]。目前國內對亞麻籽酚類物質組成及抗氧化活性研究主要集中在新疆、內蒙、山西及甘肅等主產區，而對青海亞麻籽的相關研究較少。因此，本文以山西、內蒙、甘肅產地的亞麻籽為對照，選擇了青海貴德、互助、三合、民和4個不同地區的亞麻籽，利用超聲輔助提取法提取總酚，福林酚法測定總酚含量，DPPH法測定其清除自由基的能力，以期為青海亞麻籽多酚的開發利用提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與試劑

4個青海貴德、互助、民和、三合產地的亞麻籽樣品， 3個甘肅、山西、內蒙古產地的亞麻籽樣品。

無水碳酸鈉、沒食子酸、福林酚試劑、95%乙醇、正丁烷、正己烷、氫氧化鈉，鹽酸、正丁醇、1, 1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)等，均為分析純。

1.1.2 儀器與設備

HHS-4S粉碎機；電子恒溫不銹鋼水浴鍋；RE-52旋轉蒸發儀；UV-1780紫外可見分光光度計，島津儀器(蘇州)有限公司；FA1004電子天平；DHG 9070A熱風鼓風干燥箱；KQ-300E型臺式機械超聲波清洗器；PHSJ-4A pH計；DRG9070A熱鼓風干燥箱；TGL20MW冷凍離心機。

1.2 實驗方法

1.2.1 總酚提取

將亞麻籽清洗，烘干12 h，粉碎，與正己烷按 1∶6 混合脫脂12 h，倒入離心管中，在3 000 r/min離心20 min，倒出上清液，沉淀在40℃下熱風干燥，得到脫脂亞麻籽粉樣品。準確稱取脫脂亞麻籽粉樣品3 g放入燒杯中，加入60%乙醇溶液，封口，在一定超聲溫度下超聲一段時間，抽濾，收集提取液。取30 mL提取液放入燒杯中，加入10 mL 1 mol/L的NaOH溶液，將提取液中NaOH濃度調至0.25 mol/L，反應2 h。反應結束后加入1 mol/L的鹽酸調節pH為4.0。用0.45 μm醋酸纖維素膜過濾，濾液減壓濃縮，加入30 mL 60%乙醇復溶，移至容量瓶中保存備用。

1.2.2 總酚含量測定

標準曲線繪制：精密稱取沒食子酸標準品0.020 0 g，用蒸餾水溶解并定容至100 mL容量瓶中，得質量濃度為0.2 mg/mL的標準液。準確移取沒食子酸標準液0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 mL于玻璃管中，各加1 mL 1 mol/L福林酚試劑，渦旋混合1 min使其反應，再加入3 mL 10%Na2CO3溶液振搖，加蒸餾水至10 mL，于45℃水浴中反應1.5 h，以不加標準液的溶液為空白對照，在765 nm波長下測定吸光值，以沒食子酸質量濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，建立沒食子酸標準曲線。得到的標準曲線回歸方程為y=6.575x+0.018 3，R2=0.998。

樣品中總酚含量測定：取0.3 mL 1.2.1提取的總酚復溶溶液于10 mL玻璃管中，然后加入1 mL 1 mol/L福林酚試劑，渦旋混合1 min使其反應，再加入3 mL 10%Na2CO3溶液振搖，加蒸餾水至10 mL，于45℃水浴中反應1.5 h，以不加標準液的溶液為空白對照，在765 nm波長下測定吸光值。通過標準曲線計算樣品中的總酚含量。

1.2.3 亞麻籽總酚DPPH·清除能力測定

取1 mg DPPH溶于24 mL 95%乙醇中，充分振搖均勻，避光保存備用。在10 mL玻璃管中加入3.0 mL DPPH溶液和1.0 mL 95%乙醇溶液，混勻，反應穩定后，以95%乙醇為參比，在517 nm處測吸光值(A0)；同法依次加入3.0 mL 95%乙醇溶液和1.0 mL樣品溶液，測定吸光值(A2)；依次加入3.0 mL DPPH溶液和1.0 mL樣品溶液，測定吸光值(A1)。DPPH·清除率按下式計算。

1.2.4 數據處理與分析

所有數據平行測定3次，結果取平均值，采用Microsoft Excel 2010軟件對數據進行統計分析。

2 結果與討論

2.1 亞麻籽總酚提取工藝優化

2.1.1 單因素實驗

2.1.1.1 固液比對提取效果的影響

在超聲時間20 min、超聲溫度40℃條件下，研究不同固液比對亞麻籽總酚提取的影響，結果見圖1。

從圖1可以看出，隨固液比增大，總酚含量增大，在固液比1∶15時總酚含量最高，此后隨固液比繼續增大總酚含量下降。此趨勢與孫偉潔[10]的研究結果一致。主要原因可能是乙醇用量較小時，不能將亞麻籽粉中的總酚提取出來。當乙醇用量過多時，導致超聲對亞麻籽粉的作用減弱，使提取過程受到影響[10]。因此，固液比1∶15最佳。

圖1 固液比對總酚提取效果的影響

2.1.1.2 超聲溫度對提取效果的影響

在固液比1∶15、超聲時間20 min條件下，研究不同超聲溫度對亞麻籽總酚提取的影響，結果見圖2。

圖2 超聲溫度對總酚提取效果的影響

從圖2可以看出，隨超聲溫度升高，總酚含量增大，在超聲溫度40℃時總酚含量最高，之后隨超聲溫度繼續上升總酚含量下降。這可能是隨著溫度升高，分子運動加速使酚類物質容易穿透植物組織，但溫度太高會使酚類與其他物質發生化學反應，導致結構發生變化[11]。此外，當溫度過高時溶出的亞麻膠會粘在細胞壁上，從而影響多酚提取效果。因此，超聲溫度40℃最佳。

2.1.1.3 超聲時間對提取效果的影響

在固液比1∶15、超聲溫度40℃條件下，研究不同超聲時間對亞麻籽總酚含量的影響，結果見圖3。

圖3 超聲時間對總酚提取效果的影響

從圖3可以看出，隨超聲時間延長，總酚含量增大，在超聲時間15 min時總酚含量最高，之后隨著超聲時間繼續延長總酚含量降低，這與劉濱等[12]對巴山冷杉針葉多酚提取的結果相同?？赡茉蚴浅晻r間較短時對亞麻籽的作用較小，不能使亞麻籽中的總酚全部提取出來，超聲時間過長會使活性物質流出，溶液黏度增加，從而影響亞麻籽總酚的提取。因此，超聲時間15 min最佳。

2.1.2 響應面優化實驗

2.1.2.1 模型建立和方差分析

在單因素實驗基礎上，以固液比、超聲溫度、超聲時間為因素，以總酚含量為指標，采用Design-Expert 7.0軟件進行Box-Behnken響應面實驗設計。響應面實驗設計及結果見表1。方差分析見表2。

表1 響應面實驗設計及結果

由表1數據得到模型回歸方程：總酚含量=30.07+2.64A+0.6B+0.12C-1.39AB+0.46AC+0.68BC-2.83A2-2.96B2-2.48C2。

表2 方差分析

2.1.2.2 驗證實驗

通過Design-Expert 7.0軟件得到亞麻籽總酚最佳提取工藝條件為固液比1∶17.3、超聲溫度40.1℃、超聲時間15.3 min，此條件下總酚含量為30.69 mg/g。根據實際情況將實驗條件修正為超聲溫度 40℃、超聲時間 15 min、固液比1∶17，實際總酚含量為30.21 mg/g。

2.2 不同產地亞麻籽中總酚含量及抗氧化活性(見圖4、圖5)

圖4 不同產地亞麻籽中總酚含量

圖5 不同產地亞麻籽總酚抗氧化活性

從圖4可以看出，青海貴德、互助、民和、三合亞麻籽總酚含量依次為28.70、24.51、23.16、25.11 mg/g，平均含量為25.37 mg/g，青海貴德的亞麻籽總酚含量明顯高于青海其他3個地區亞麻籽的，而民和的亞麻籽總酚含量最低。甘肅、內蒙古、山西產地亞麻籽總酚含量依次為19.97、21.43、22.38 mg/g。

從圖5可以看出，青海、甘肅、內蒙、山西4個產地亞麻籽樣品都具有較強的抗氧化能力，但不同產地樣品間存在差異性。其中產自青海的亞麻籽總酚抗氧化能力較強，DPPH·清除率平均為47.44%；其次為山西、內蒙古，DPPH·清除率分別為 42.43%、42.18%。產自甘肅的亞麻籽總酚抗氧化能力最弱，DPPH·清除率為41.48%。結果表明，青海亞麻籽總酚在含量水平和抗氧化能力方面占一定優勢。

青海本地不同地區亞麻籽總酚DPPH·清除率大小依次為貴德 (51.06%)>三合 (49.13%)>互助 (46.94%)>民和(42.62%)。結果表明，不同產地及同一產地不同地區間亞麻籽中總酚含量及抗氧化能力存在差異，這與臧茜茜等[13]的研究結果一致。研究表明，油料的總酚含量及抗氧化活性會受品種、生長環境、氣候條件、貯藏時間等因素的影響，導致總酚含量及抗氧化活性存在不同程度的差異。且不同品種的同一物種間，營養成分含量也不同[14-16]。

3 結 論

在單因素實驗基礎上，通過Box-Behnken響應面實驗設計，得到亞麻籽總酚提取的最佳工藝條件為固液比1∶17、超聲溫度40℃、超聲時間15 min，在此條件下總酚含量達到30.21 mg/g。

總酚含量及DPPH·清除能力實驗表明，青海亞麻籽中總酚含量和抗氧化能力高于其他產地，且青海本地不同地區亞麻籽間總酚含量及抗氧化能力存在差異。青海貴德、三合、互助、民和的亞麻籽總酚含量依次為28.70、25.11、24.51、23.16 mg/g，DPPH·清除率依次為51.06%、49.13%、46.94%、42.62%。山西、內蒙古、甘肅產亞麻籽中總酚含量依次為22.38、21.43、19.97 mg/g，DPPH·清除率依次為42.43%、42.18%、41.48%?？傮w來說，青海亞麻籽的總酚含量及抗氧化能力高于其他產地，具有較好的應用前景。