迷迭香提取物對自由基誘導蛋白質、油脂及DNA氧化的抑制作用

劉勝男，余敏敏，郭曉莉，潘菁菁，相啟森，*

（1.鄭州輕工業大學食品與生物工程學院，河南鄭州450001；2.食品生產與安全河南省協同創新中心，河南鄭州450001）

活性氧（reactive oxygen species，ROS）是一類含有不成對電子的氧原子及原子團，包括超氧陰離子（O2-）、羥自由基（·OH）和過氧化氫（H2O2）等[1]。研究顯示，機體過量產生的ROS會引發蛋白質氧化、脂質過氧化和DNA氧化損傷等，進而誘發人體多種疾病[2-3]。例如，胡靜等[4]研究發現氧化應激可能會誘發天皰瘡，Ram等[5]發現ROS誘導的DNA氧化損傷與阿爾茲海默癥等神經退行性疾病的發生密切相關。為了降低氧化應激對機體造成的損傷，一些天然抗氧化劑受到研究者的廣泛關注。研究證實，兒茶素、沒食子酸、植物多酚等具有較強的清除自由基能力及抗衰老、抗癌、消炎及抗氧化等功能[6-8]，能夠有效預防和減緩氧化應激反應的發生。

迷迭香（Rosmarinus officinalis L.）是一種原產于地中海沿岸的天然香料植物，是目前廣泛應用的食品添加劑[9]。迷迭香含有的迷迭香酸、迷迭香酚、鼠尾草酸和鼠尾草酚等已被證實具有抗氧化、抗菌、消炎和抗腫瘤等生理活性功能，但是在生物大分子和油脂氧化損傷抑制作用方面的研究卻相對較少[9-12]。因此本研究通過Cu2+/H2O2、2，2'-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽[2，2'-azobis（2-amidinopropane）hydrochloride，AAPH]誘 導牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）氧化損傷，FeSO4、偶氮二異庚腈 [2，2'-azobis （2，4-di-methylvaleronitrile），AMVN]誘導亞油酸（linoleic acid，LA）氧化損傷以及AAPH誘導鯡魚精DNA（herring sperm DNA，hsDNA）氧化，研究在此過程中迷迭香提取物對氧化損傷的抑制作用，為迷迭香在抗氧化功能食品中的應用提供科學理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

迷迭香提取物：食品營養與安全實驗室自制；亞油酸（linoleic acid，LA）、2，2'-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽（AAPH）和偶氮二異庚腈（AMVN）：阿拉丁試劑（上海）有限公司；牛血清白蛋白（BSA）、鯡魚精DNA（hsDNA）、考馬斯亮藍R-250：北京索萊寶科技有限公司；β-巰基乙醇、十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、丙烯酰胺、N，N'-亞甲雙丙烯酰胺、甘氨酸、N，N，N'，N'-四甲基二乙胺（TEMED）、異丙醇、三羥甲基氨基甲烷、溴酚藍、過硫酸銨和二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）：上海麥克林生化科技有限公司；三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、2，4-二硝基苯肼（2，4-dinitrophenylhydrazine，DNPH）：北京百靈威科技有限公司；CuSO4·5H2O、30%雙氧水、冰乙酸和 FeSO4·7H2O：天津市大茂化學試劑廠；丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

PowerPacTM通用電泳儀電源、Mini-PROTEANTetra電泳槽、ChemiDocTMXRS+化學發光成像系統：美國Bio-Rad公司；5427R型高速冷凍離心機：德國Eppendorf公司；Multiskan GO型全波長酶標儀：美國Thermo Fisher Scientific公司；2450型紫外-可見分光光度計：日本Shimadzu公司；HH-8J型恒溫水浴鍋：常州潤華電器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 迷迭香提取物對Cu2+/H2O2誘導蛋白氧化和羰基化的影響

在終濃度為2 mg/mL的BSA溶液（pH6.0、0.2 mol/L PBS 溶解） 中加入 100 μL 不同濃度（0、25、50、100、200、500 μg/mL）的迷迭香提取物溶液，混勻后依次加入終濃度為400 μmol/L和10 mmol/L的CuSO4溶液和H2O2溶液，反應總體積為1 mL，封口后置于37℃水浴反應90 min。反應結束后，采用10%分離膠進行SDSPAGE分離蛋白，考馬斯亮藍R-250染色法進行染色，檢測BSA氧化損傷程度，采用DNPH比色法檢測BSA羰基含量。

1.3.2 迷迭香提取物對AAPH誘導蛋白氧化和羰基化的影響

在終濃度為2 mg/mL的BSA溶液中加入100 μL不同濃度的迷迭香提取物溶液，混勻后加入終濃度為100 mmol/L的 AAPH 溶液（pH 7.4，PBS溶解），反應總體積為1 mL，封口置于37℃水浴反應4 h。反應結束后，測定BSA的氧化損傷程度和羰基含量。

1.3.3 BSA氧化損傷程度測定

取50 μL反應樣品，分別加50 μL 5×上樣緩沖液混勻后沸水浴5 min，采用10%分離膠分離蛋白，經考馬斯亮藍R-250溶液（1 g/L）染色30 min，脫色液脫色過夜，采用ChemiDocTMXRS+化學發光成像系統進行成像并使用Image Lab軟件對蛋白條帶進行半定量分析。

1.3.4 BSA羰基含量測定

取1 mL反應液加入3 mL 0.01 mol/L DNPH溶液，混勻后于室溫（25℃）下避光反應30 min。反應結束后加入4 mL、20%TCA溶液，混勻后4 000 r/min離心10min。棄上清液后，加入3mL乙醇-乙酸乙酯混合液（體積比1∶1）進行洗滌，重復3次。最后一次離心后棄上清液，加入2 mL、6 mol/L鹽酸胍溶液，混勻后采用紫外-可見分光光度計測定其在370 nm處吸光值。蛋白羰基含量（nmol/mg）使用摩爾吸光系數22 000 mol/（L·cm）來計算。

1.3.5 迷迭香提取物對FeSO4誘導亞油酸氧化的影響

在終濃度為1 mmol/L的LA（乙醇溶解）中，加入100 μL不同濃度的迷迭香提取物溶液，混勻后再加入終濃度為100 μmol/L的FeSO4溶液，反應總體積為1 mL，封口后于37℃水浴避光反應24 h。反應結束后，以共軛二烯和MDA含量表示亞油酸脂質氧化水平。參照Esterbauer等報道的方法檢測共軛二烯含量[13]。用紫外-可見分光光度計測定樣品在233 nm處的吸光度，并根據共軛二烯的摩爾吸光系數2.8×104L/（mol·cm）計算共軛二烯含量，結果以μmol/L表示。采用MDA試劑盒測定樣品中MDA含量，結果表示為nmol/mL。

1.3.6 迷迭香提取物對AMVN誘導亞油酸氧化的影響

在終濃度為1 mmol/L的LA中，加入100 μL不同濃度的迷迭香提取物溶液，混勻后再加入終濃度為1 mmol/L的AMVN溶液（甲醇溶解），反應總體積為1 mL，封口后于37℃水浴避光反應12 h。反應結束后，以共軛二烯和MDA含量為指標評價亞油酸脂質氧化水平。

1.3.7 迷迭香提取物對AAPH誘導DNA氧化損傷的影響

在終濃度為2 mg/mL的hsDNA（pH6.0、0.2 mol/L PBS溶解）中，加入100 μL不同濃度的迷迭香提取物溶液，再加入終濃度為40 mmol/L的AAPH溶液，反應總體積為1 mL，混勻后于37℃恒溫水浴12 h。采用南京建成研究所MDA試劑盒測定hsDNA氧化損傷水平，并根據公式（1）計算迷迭香提取物對AAPH誘導MDA生成的抑制率：

式中：A0為空白組（不加誘導劑和迷迭香提取物）的吸光度；A1為誘導組的吸光度；A2為同時加入迷迭香提取物和誘導劑后的吸光度。

1.3.8 統計學分析

所有試驗重復3次，結果表示為平均值±標準差。采用SPSS21.0統計軟件進行數據處理，最小顯著差異法（least significant difference，LSD）進行顯著性分析，p<0.05表示差異顯著，采用GraphPad Prism 7.0繪圖軟件進行繪圖。

2 結果與討論

2.1 迷迭香提取物對Cu2+/H2O2誘導蛋白氧化的影響

迷迭香提取物對Cu2+/H2O2誘導BSA氧化的影響見圖1。

圖1 迷迭香提取物對Cu2+/H2O2誘導BSA氧化的影響Fig.1 Effect of rosemary extract on oxidative damage of BSA induced by Cu2+/H2O2

由圖1A可知，與對照組相比，經Cu2+/H2O2誘導后，試驗組BSA條帶顏色明顯變淺；與模型組相比，隨著迷迭香提取物濃度的增加，BSA條帶顏色明顯變深。由圖1B可知，與對照組相比，經Cu2+/H2O2誘導后，試驗組BSA條帶相對灰度顯著降低（p＜0.05）；與模型組相比，BSA條帶相對灰度隨迷迭香提取物濃度的增加而顯著升高（p＜0.05），該結果與張月等[14]研究結果相一致。出現該結果的原因可能是，Cu2+/H2O2能夠通過Fenton反應產生羥自由基誘導BSA發生氧化降解，從而造成蛋白條帶灰度降低，而迷迭香提取物含有的多酚類物質能夠清除羥自由基，從而抑制蛋白氧化降解[15]。

2.2 迷迭香提取物對AAPH誘導蛋白氧化的影響

迷迭香提取物對AAPH誘導BSA氧化的影響見圖2。

圖2 迷迭香提取物對AAPH誘導BSA氧化的影響Fig.2 Effect of rosemary extract on oxidative damage of BSA induced by AAPH

如圖2所示，與對照組相比，AAPH處理組BSA條帶顏色變淺，BSA條帶相對灰度顯著降低（p＜0.05）；與模型組相比，BSA條帶相對灰度隨提取物濃度的升高而顯著升高（p＜0.05），這與Cu2+/H2O2誘導蛋白氧化損傷的結果相一致。以上結果表明，迷迭香提取物能夠有效抑制AAPH誘導的BSA氧化降解。

2.3 迷迭香提取物對自由基誘導蛋白羰基化的影響

迷迭香提取物對自由基誘導BSA羰基化的影響見圖3。

圖3 迷迭香提取物對自由基誘導BSA羰基化的影響Fig.3 Effect of rosemary extract on carbonylation of BSA induced by free radicals

蛋白羰基化是衡量蛋白質氧化損傷的一個重要指標[16]。從圖3A可知，對照組BSA中羰基含量很低，為3.80 nmol/mg；經Cu2+/H2O2處理90 min后，BSA羰基含量顯著升高至30.09 nmol/mg（p<0.05）。迷迭香提取物能有效抑制Cu2+/H2O2誘導BSA中羰基含量的升高（p<0.05），其抑制作用隨提取物添加濃度的升高而增強。由圖3B可知，AAPH處理組BSA羰基含量較對照組顯著升高（p<0.05）；迷迭香提取物能有效抑制AAPH誘導BSA中羰基含量的升高（p<0.05），其抑制作用隨添加濃度的升高而增強，與Cu2+/H2O2誘導下的結果相類似。

迷迭香提取物中含有的迷迭香酸、迷迭香酚、鼠尾草酸和鼠尾草酚等多種多酚類物質[10，17]，能夠通過清除Cu2+/H2O2及AAPH反應體系產生的羥自由基、烷氧自由基等抑制BSA羰基化修飾。

2.4 迷迭香提取物對FeSO4誘導亞油酸氧化的抑制作用

迷迭香提取物對FeSO4誘導亞油酸氧化的影響見圖4。

圖4 迷迭香提取物對FeSO4誘導亞油酸氧化的影響Fig.4 Effect of rosemary extract on LA oxidation induced by FeSO4

LA是一種常見的多不飽和脂肪酸且極易發生脂質氧化[18]。如圖4A所示，FeSO4處理組中LA共軛二烯含量為 152.20 μmol/L，顯著高于對照組（p<0.05）；迷迭香提取物能夠有效抑制FeSO4誘導LA共軛二烯含量的升高（p<0.05），其抑制作用隨添加濃度的升高而增強。

MDA是油脂中不飽和脂肪酸氧化分解所產生的次級氧化產物[19]。由圖4B可知，對照組LA氧化所產生的MDA含量很低，而在模型組中，FeSO4單獨處理后，LA發生脂質氧化，導致其產生的MDA含量顯著升高（p＜0.05）；隨著處理組中迷迭香提取物濃度的升高，LA氧化所產生的MDA含量逐漸降低。這說明迷迭香提取物能夠有效抑制LA氧化，且抑制作用隨其濃度的升高而增強。這與姚雯等[20]研究血根堿對FeSO4誘導LA氧化影響的結果相一致。

2.5 迷迭香提取物對AMVN誘導亞油酸氧化的抑制作用

迷迭香提取物對AMVN誘導亞油酸氧化影響見圖5。

圖5 迷迭香提取物對AMVN誘導亞油酸氧化影響Fig.5 Effect of rosemary extract on LA oxidation induced by AMVN

AMVN在熱分解條件下會產生烷氧自由基，從而引發LA脂肪氧化的鏈式反應，加速油脂氧化。由圖5A可知，處理組中較低濃度的迷迭香提取物未能顯著抑制共軛二烯產物的生成，而其濃度為100 μg/mL～500 μg/mL 時，LA 脂質氧化顯著得到抑制（p＜0.05）；由圖5B可知，在AMVN作用下，模型組LA發生脂質氧化，而對照組LA氧化程度較低；從處理組中可以得出，迷迭香提取物可以顯著（p＜0.05）抑制MDA的生成，且其抑制效果隨提取物濃度（25 μg/mL～500 μg/mL）的升高而逐漸增強。

2.6 迷迭香提取物對AAPH誘導DNA氧化損傷的影響

迷迭香提取物對AAPH誘導DNA氧化損傷的抑制作用見圖6。

圖6 迷迭香提取物對AAPH誘導DNA氧化損傷的抑制作用Fig.6 Inhibitory effects of rosemary extract on AAPH-initiated DNA oxidative damage

DNA是機體遺傳信息的載體，AAPH產生的自由基會攻擊DNA，引發DNA氧化損傷，通過測定DNA氧化產物在532 nm處的吸光度可判斷其氧化損傷的程度。由圖6可知，迷迭香提取物能夠有效抑制AAPH誘導hsDNA氧化，其抑制率隨添加濃度的升高而顯著升高（p＜0.05）。

3 結論

本試驗表明迷迭香提取物對不同自由基引發的蛋白質氧化降解、羰基化修飾，脂質氧化和DNA氧化損傷均有顯著的抑制作用，且抑制作用隨其濃度的升高而增強；出現這一結果的原因可能是迷迭香提取物阻斷了Cu2+/H2O2、AAPH、FeSO4和AMVN等誘導劑引發的自由基鏈式反應從而抑制生物大分子及LA的氧化損傷。該研究為迷迭香提取物預防某些與蛋白氧化損傷有關的疾病及功能性食品的開發提供了一定的理論依據。在今后的試驗中應采用動物試驗進一步評價迷迭香提取物對自由基誘導蛋白質、油脂及DNA氧化的抑制作用及機制。