真空浸漬輔助L-半胱氨酸處理對貯藏期鮮切馬鈴薯的護色作用

（山西師范大學食品科學學院，山西臨汾041004）

馬鈴薯作為世界四大主糧之一，是碳水化合物、膳食纖維、維生素及礦物質等營養物質的良好來源。全球有100多個國家種植馬鈴薯，總產量超過3.0×108t，并呈逐年上升趨勢[1-2]。馬鈴薯除鮮食之外，還可制作成薯片、薯條、薯泥等多種加工產品，但馬鈴薯在切分、削皮等加工過程中，由于機械性損傷而導致酶促褐變的產生，對其感官品質和營養價值產生不利影響[3-5]。酶促褐變是由于多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）氧化酚類化合形成鄰醌，鄰醌再聚合產生黑褐色物質。在完整的植物細胞中，氧化酶類和多酚存在于不同的細胞器中，因而不會發生氧化反應，但細胞組織破壞時，這種隔離被打破，從而引發酶促褐變[6]。

化學方法是控制鮮切果蔬酶促褐變的主要手段之一，如采用檸檬酸[7]、抗壞血酸及其衍生物[7-8]、EDTA[9]、曲酸[10]處理，或采用多種護色劑組合方式處理[8，11]。L-半胱氨酸（L-cysteine，L-cys）是一種生物體內常見的含硫氨基酸，廣泛用于醫藥、食品、化妝品的加工制造。諸多研究表明，L-cys是酶促褐變最有效的抑制劑之一，通過與醌中間體重新作用形成穩定無色化合物，防止酶促褐變的形成[12]。但也有研究表明，L-cys可直接作用于PPO，降低其活性而抑制酶促褐變的發生[13-14]。陳晨等[14]研究了L-cys對鮮切蘋果褐變控制的生理機制，結果表明，與蒸餾水處理（對照組）相比，在貯藏初期L-cys處理降低了鮮切蘋果的PPO活性，顯著抑制了鮮切蘋果的褐變。廖春麗等[15]研究了L-cys對馬鈴薯中PPO活性的影響，結果表明，L-cys對馬鈴薯活性抑制作用明顯，隨著L-cys濃度增大，酶活性降低幅度越大?？梢奓-cys能夠有效控制鮮切果蔬酶促褐變，但L-cys對控制貯藏過程中鮮切馬鈴薯酶促褐變的生理機制仍缺乏系統研究。

真空浸漬（vacuum impregnation，VI）作為食品加工中常用的非熱物理輔助方法，廣泛用于食品加工中[16-17]。本研究擬采用VI輔助L-cys，在一定的VI條件下，將L-cys溶液浸透到鮮切馬鈴薯細胞間隙內，以期達到抗褐變效果。通過分析鮮切馬鈴薯在4℃、15 d貯藏過程中，褐變指數（browning index，BI）、PPO、過氧化物酶（peroxidase，POD）、苯丙氨酸解氨酶（phenylalanineammonialyase，PAL）活性、總酚含量及抗氧化活性等的變化，系統評價L-cys對鮮切馬鈴薯的護色效果，以期為鮮切果蔬護色研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬鈴薯（晉薯16號）：山西臨汾堯豐市場；L-半胱氨酸（食品級）：廣東味多美食品配料有限公司；鄰苯二酚（分析純）：南京化學試劑股份有限公司；福林酚（分析純）：上海源葉有限公司；聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVPP）：天津市科密歐有限公司；硼酸、硼砂（分析純）：天津市致遠化學試劑有限公司；愈創木酚、水楊酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、碳酸鈉等：均為分析純，天津市光復科技發展有限公司。

1.2 儀器與設備

2XZ-1型真空泵：上海萬經泵業制造有限公司；NR110型精密色差儀：深圳市三恩時科技有限公司；H1805R型臺式高速冷凍離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；752型紫外可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；LC-Q01型切片機：佛山市順德區韓泰電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鮮切馬鈴薯的VI處理

馬鈴薯經去皮、切片（0.3 cm），浸泡于300 mL L-cys（0.7 g/L）溶液中，再置于真空浸漬裝置內，在真空度15.11×10-3MPa條件下處理10 min，恢復大氣壓狀態后再浸漬處理10 min。將VI處理后的樣品拭干后，均勻放入托盤中并用聚乙烯保鮮膜包好，置于4℃冷庫中貯藏15 d。定期取樣用于測定分析生理生化變化。

1.3.2 鮮切馬鈴薯BI值的測定

利用色差儀測定鮮切馬鈴薯L*、a*、b*值，它是代表物體顏色的色度值，也就是顏色空間坐標，其中L*值表示樣品的明亮程度，即明度差，a*值樣品的：紅綠色調差，b*值代表樣黃藍色調差。根據陳晨等[14]的研究計算鮮切馬鈴薯BI值。

1.3.3 相關酶活性的測定

PPO活性是參照程麗林等[18]的方法測定。酶活性的定義：以單位酶液每分鐘內吸光度值每增加0.01為一個活力單位（U/g）。

POD活性是參照Terefe等[19]的方法測定，并稍作改動。稱取5 g鮮切馬鈴薯，加入20 mL磷酸鹽緩沖溶液（磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉，0.1 mol/L、pH 6.8）研磨，離心 15 min（12 000 r/min、4℃），上清液即為粗酶液。分別取1 mL的磷酸緩沖溶液、1 mL的愈創木酚溶液（0.02 mol/L）、2 mL的過氧化氫溶液（0.02 mol/L）及 1 mL酶液，加入到試管中。對照組加入1 mL超純水代替酶液。將反應液充分搖勻，在470 nm處測定吸光值。每15 s記錄一次數據，共記錄3 min。以單位酶液每分鐘吸光度值每增加0.01為一個活力單位（U/g）。

PAL活性是參照王禮群等[20]的方法測定，并稍作改動。分別稱取10 g鮮切馬鈴薯、0.8 g PVPP，加入32 mL硼酸緩沖液（pH 8.8，含0.4 μL/mL的巰基乙醇）冰浴研磨，離心 15 min（10 000 r/min，4 ℃），上清液即為粗酶液。試管中分別加入2 mL硼酸緩沖液、2 mL L-苯丙氨酸（0.02 mol/L）及0.5 mL酶液，空白組以0.5 mL緩沖液替代酶液，在290 nm處測定吸光值。再將反應液水?。?7℃）30 min，加入 0.5 mL鹽酸（0.6 mol/L）終止反應，冷卻后于290 nm處測定吸光值。以1 h內A290增加0.01為PAL的一個活性単位。

1.3.4 總酚含量的測定

稱取10 g鮮切馬鈴薯，加入15 mL、80%的乙醇冰浴研磨，離心 15 min（10 000 r/min、4 ℃），再將上清液通過0.45 μm過濾器得到提取液備用。參照Piccolella等[21]的方法測定總酚含量。

1.3.5 抗氧化能力的測定

以鮮切馬鈴薯對羥基自由基的清除能力，作為抗氧化能力的指標，并參照齊美娜[22]的方法測定羥基自由基的清除能力。

1.3.6 數據處理與統計分析

采用IBM SPSS Statistics 20.0軟件對試驗數據進行統計學處理，結果以平均值±標準偏差表示。采用Duncan多重比較法進行差異顯著性分析，顯著性以p＜0.05為顯著。采用Origin 2018軟件繪圖。

2 結果與討論

2.1 L-cys處理對鮮切馬鈴薯BI值的影響

通過BI值可以反映出鮮切馬鈴薯的褐變程度，并能直觀判斷出其外觀品質。L-cys處理對貯藏期鮮切馬鈴薯BI值的影響見圖1。

圖1 L-cys處理對貯藏期鮮切馬鈴薯BI值的影響Fig.1 Effect of L-cys treatment on BI value of fresh-cut potatoes during storage

如圖1所示，在貯藏期間，試驗組與對照組鮮馬鈴薯BI值總體呈上升趨勢，但試驗組BI值顯著低于對照組BI值（p＜0.05），表明在貯藏期內L-cys處理延緩了鮮切馬鈴薯褐變程度。在貯藏前3 d，對照組鮮切馬鈴薯BI值顯著上升，隨后呈平緩上升趨勢。試驗組在前9 d的貯藏期內，鮮切馬鈴薯BI值呈緩慢上升趨勢，但貯藏后期呈急促上升趨勢，證明在0～9 d內，L-cys處理對鮮切馬鈴薯酶促褐變的控制作用最明顯。

2.2 L-cys處理對鮮切馬鈴薯相關酶活性的影響

鮮切馬鈴薯酶促褐變程度與PPO活性強弱密切相關，L-cys對鮮切馬鈴薯PPO活性的影響如圖2所示。

圖2 L-cys處理對貯藏期鮮切馬鈴薯PPO活性的影響Fig.2 Effect of L-cys treatment on PPO activity of fresh-cut potatoes during storage

試驗組和對照組鮮切馬鈴薯PPO活性，隨貯藏時間的延長均呈先上升后下降趨勢，但試驗組PPO活性顯著低于對照組（p＜0.05）活性。在整個貯藏期，對照組的PPO活性變化趨勢與陳晨等[14]的研究結果相似，在貯藏第9天時達到最大值（62.41 U/g）。試驗組PPO活性在貯藏前期呈平緩上升趨勢，在第4天時達到最高（41.11 U/g），隨后呈平緩下降趨勢。目前L-cys對鮮切果蔬褐變的抑制機理尚有爭論，但Ali等[7]研究認為L-cys是一種高效的PPO抑制劑，它對膜PPO活性具有較強的抑制作用。L-cys的-SH基團對PPO活性中心銅離子具有親和力，通過對PPO活性中心的結構性修飾而改變其活性。在本研究中，貯藏期內L-cys處理延遲了鮮切馬鈴薯PPO活性的上升，進而可降低酶促褐變的程度。

POD是一種存在于植物體中活性較高的酶，與呼吸作用、光合作用及氧化作用密切相關。在鮮切果蔬中，POD可以利用H2O2釋放出的O2氧化酚類物質，引發酶促褐變反應。曲酸處理對貯藏期鮮切馬鈴薯POD活性的影響見圖3。

圖3 L-cys處理對貯藏期鮮切馬鈴薯POD活性的影響Fig.3 Effect of L-cys treatment on POD activity of fresh-cut potatoes during storage

由圖3可知，在貯藏0～9 d，試驗組鮮切馬鈴薯POD活性呈先下降后上升趨勢，除第6天外，試驗組POD活性顯著低于對照組（p＜0.05）。但隨著貯藏時間延長，對照組POD活性呈急促上升趨勢，試驗組則呈下降趨勢，這可能與貯藏期的微生物侵染有關，貯藏后期微生物侵染程度加大，從而誘導對照組鮮切馬鈴薯POD活性升高，也可能是貯藏過程中產生了新的POD同工酶[23]。一般許多果蔬組織中POD活性都伴隨機械性損傷而升高，但在貯藏期內，試驗組POD活性并沒出現大幅上升現象，說明L-cys處理有效抑制了鮮切馬鈴薯POD活性升高。

PAL主要存在于高等植物、酵母、菌類等生物體內，為多種酚類化合物及類黃酮終產物提供前體，可催化L-cys脫去氨而促進酚類化合物的合成。曲酸處理對貯藏期鮮切馬鈴薯PAL活性的影響見圖4。

圖4 L-cys處理對貯藏期鮮切馬鈴薯PAL活性的影響Fig.4 Effect of L-cys treatment on PAL activity of fresh-cut potatoes during storage

由圖4可知，在貯藏期內試驗組和對照組鮮切馬鈴薯PAL活性均呈先上升趨勢，這可能是切割傷害誘導了貯藏過程中鮮切馬鈴薯PAL活性升高[24]，但在整個貯藏期內試驗組PAL活性均顯著低于對照組（p＜0.05），說明L-cys處理（試驗組）可以延緩鮮切馬鈴薯PAL活性的上升，有利于控制鮮切馬鈴薯酚類化合物的合成。

2.3 L-cys處理對鮮切馬鈴薯總酚含量的影響

多酚化合物是果蔬中重要的抗氧化物質之一，同時也是PPO、POD的底物，參與果蔬的酶促褐變反應[25]。L-cys處理對貯藏期鮮切馬鈴薯多酚含量的影響見圖5。

圖5 L-cys處理對貯藏期鮮切馬鈴薯多酚含量的影響Fig.5 Effect of L-cys treatment on polyphenol content of fresh-cut potatoes during storage

如圖5所示，試驗組和對照組鮮切馬鈴薯總酚含量都呈上升趨勢。在貯藏前6 d，試驗組總酚含量顯著低于對照組（p＜0.05），但隨著貯藏時間的延長則相反。貯藏期間的鮮切馬鈴薯PAL活性逐漸升高，促進了酚類化合物的合成，因而兩組的總酚含量都呈上升趨勢。但隨貯藏時間延長（9 d～15 d），由于試驗組鮮切馬鈴薯PPO活性顯著低于對照組（p＜0.05），這可能是造成試驗組總酚含量高于對照組的原因（p＜0.05）。

2.4 L-cys處理對鮮切馬鈴薯抗氧化能力的影響

羥基自由基是自然界中僅次于氟的強氧化劑，具有極強的氧化能力。L-cys處理對貯藏過程中鮮切馬鈴薯羥基自由基清除能力的影響見圖6。

圖6 L-cys處理對貯藏過程中鮮切馬鈴薯羥基自由基清除能力的影響Fig.6 Effect of L-cys treatment on hydroxyl radical scavenging activity of fresh-cut potatoes during storage

如圖6所示，在貯藏期間，試驗組鮮切馬鈴薯對羥基自由基清除能力呈上升趨勢，對照組則呈先上升后下降趨勢。在貯藏后期（12 d～15 d），試驗組對羥基自由基清除能力顯著高于對照組（p＜0.05），這可能與試驗組總酚含量在貯藏后期的合成和積累有關[26]?？傮w來說，貯藏期間L-cys處理誘導了鮮切馬鈴薯中總抗氧化物質的合成和積累，其清除羥基自由基能力得到了提高，在一定程度上可減輕活性氧對馬鈴薯細胞組織產生的氧化損傷。

3 結論

目前諸多國內外學者認為，L-cys處理對果蔬酶促褐變控制機理有兩種可能的形式。一種是硫醇類化合物可以結合PPO分子活性中心的銅離子從而改變其活性。另一種是硫醇類化合物可在酶促反應過程中與產生的醌類發生非酶催化反應，而形成一種化學性質穩定的無色化合物[7，14，23，27]。在本研究中，與對照組比較，L-cys處理對貯藏期鮮切馬鈴薯PPO和POD活性均有顯著抑制作用。說明L-cys可能與馬鈴薯酶蛋白不可逆地結合，從而抑制其酶促褐變反應[13]。但也有研究認為L-cys能與酶促褐變產物醌類化合物反應生成穩定的無色化合物，而防止醌類氧化形成有色物質[28]。根據本研究結果，認為貯藏期鮮切馬鈴薯BI的變化由以上兩種機制共同作用的結果。另外，切割損傷誘導了貯藏期鮮切馬鈴薯PAL活性的升高，隨之總酚含量也呈升高趨勢，但與對照組相比，L-cys處理顯著抑制了貯藏期鮮切馬鈴薯PAL活性（p＜0.05）。由此可見，通過L-cys處理可延緩鮮切馬鈴薯貯藏期間的酶促褐變，進而可保護其貯藏品質。