輻照處理對柄曲霉素的降解效果研究

趙亞榮，王瓊珊，王旭，劉香香，王富華，*

（1.廣東省農業科學院農產品公共監測中心，廣東廣州510640；2.農業部農產品質量安全檢測與評價重點實驗室，廣東廣州 510640；3.廣東食品藥品職業學院，廣東廣州510520）

真菌毒素（mycotoxins）是真菌在合適的條件下代謝產生的有毒次級代謝產物，其中有30多種真菌菌株的代謝產物對動物和人類具有致病性。目前，真菌毒素污染已經成為重要的食品安全問題。因此，在人類密切關注食物和食品衛生質量安全的今天，真菌毒素對食物的污染已成為不可忽視的問題。其中，黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）的研究最為深入，且取得了很大的進展，而新近的研究表明，AFB1的代謝合成前體物質柄曲霉素（sterigmatocystin，STC）已逐漸成為真菌毒素研究中的另一個熱點。

在生物代謝過程中，STC是AFB1的倒數第二個前體，二者共享同一條代謝途徑。目前，由于缺乏相關報道或流行病學研究數據來評估其致癌性，國際癌癥研究機構（International Agency for Research on Cancer，IARC）將STC劃分為2B級致癌物，即被認為是對人類可能致癌的物質[1-2]。2013年6月7日應歐盟委員會（European Commission，EC）要求，歐盟食品安全局（European Food Safety Authority，EFSA）對食品和飼料樣品中的STC對公眾的健康風險發布了意見[3]。很多研究報道發現，STC可污染谷物、谷物加工品、堅果、奶酪和調味料等食品，并可在食物中長期存留，隨后通過食物鏈間接地進入人體，造成食品安全問題，威脅人類和動物的健康[4-5]。

輻照處理是一個傳統的物理過程，廣泛應用于農產品上的殺菌、滅蟲、保鮮以及降低致敏源的致敏作用等[6-9]。食品輻射較傳統的滅菌、保鮮等方法相比，可節省能耗，且處理后無污染、無殘留；同時，輻射技術可以在常溫條件下進行，不會引起被輻射物品內部溫度的升高，因此可較好地保持食品原有的特性。大量的研究已經表明紫外照射、γ射線、電子束、X射線和微波等輻射技術可有效去除農產品中的真菌毒素。2007年，Nagy等研究報道γ射線輻照可有效降解小麥、大麥和玉米中的伏馬菌素，當輻照劑量為7 kGy時，小麥和玉米中的伏馬菌素可完全去除[10]。Tripathi等指出紫外照射可有效地降解AFB1，其降解率隨紫外輻射濃度的變化而不同[11]。本研究以STC為研究對象，利用不同劑量的60Co-γ射線對STC進行輻射，探索輻照對溶液中STC是否具有降解作用，從而為食品中STC的去除提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

柄曲霉素標準品（純度≥99%）、甲酸、甲酸銨（純度≥98%，質譜用）：美國Sigma-Aldrich公司；乙腈、甲醇、氯仿（色譜級）：美國默克公司；Milli-Q去離子水發生器：美國Millipore公司。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜儀（LC-30AD）、帶電噴霧離子源三重四級桿質譜儀（LCMS-8050）、XR-ODSⅢC18色譜柱（75 mm×2.0 mm，1.6 μm）：日本島津公司；KQ-250DE超聲儀：昆山市超聲儀器有限公司；MS3 basic渦旋儀：德國IKA公司；鈷-60輻照裝置：廣州輻銳高能技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

STC標準儲備液：取2 mg STC標準品溶于200 mL乙腈中，配制成10 mg/L的STC標準儲備液，-20℃保存備用。

STC標準工作液：準確移取STC標準儲備液置于容量瓶中，用乙腈梯度稀釋為 0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50 μg/L 的標準工作液，4℃保存備用。

1.3.2 標準曲線的繪制

分別取1 mL的STC標準工作液，按照高效液相色譜串聯質譜（high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS） 的方法條件進樣，測得STC各濃度標準工作液的峰面積。以峰面積為縱坐標，STC濃度作為橫坐標繪制標準曲線，采用外標法定量。在0.1 μg/L～50 μg/L的濃度范圍內，色譜峰面積與STC濃度的線性關系良好，線性回歸方程為y=540 258x+12 392.9，R2=0.999 8。

1.3.3 測試樣品的制備

不同溶劑樣品制備：將10 mg/L的STC標準儲備液分別用乙腈、水、甲醇和氯仿稀釋至100 μg/L，4℃保存備用。

不同濃度溶液制備：準確移取10 mg/L的STC標準儲備液置于容量瓶中，分別配制成濃度為50、100、200 μg/L 3種不同濃度的溶液，4℃保存備用。

1.3.4 γ射線輻照處理及劑量測定

輻照處理在廣州輻銳高能技術有限公司進行，輻照源為60Co裝置，輻照計量分別設定為 0、3、6、9、12、15 kGy，用重鉻酸鉀銀劑量計跟蹤比對，測定樣品的實際吸收劑量。每一處理設置3個平行。

1.3.5 STC的測定方法

采用高效液相色譜-串聯質譜法對STC進行測定。色譜條件：色譜柱C18（75 mm×2.0 mm，1.6 μm）；流動相：A為0.1%甲酸水+5 mmol/L甲酸銨，B為乙腈；梯度洗脫程序：0～1 min，10%B，1 min～6 min，90%B；6 min～6.1 min，10%B；6.1 min～9 min，10%B；流速0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：5 μL。

質譜條件：電噴霧離子源；以正離子掃描作為掃描方式；以多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）作為檢測方式；離子源接口溫度為300℃；加熱塊溫度為400℃；脫溶劑溫度為250℃；加熱氣流速為10 L/min；干燥氣流速為10 L/min；霧化氣流速為3 L/min；STC的母離子為[M+H]+（m/z 324.6）子離子分別為 310.0（25 eV）和 281.0（36 eV），其中 m/z 310.0 為定量離子。

1.3.6 數據處理

試驗樣品檢測重復3次，采用Origin8.0對檢測結果的數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 不同溶劑對STC輻照降解效果的影響

不同溶劑對STC輻照降解影響結果見圖1。

圖1 不同溶劑對柄曲霉素降解率的影響Fig.1 Effect of different solutions on sterigmatocystin degradation rate

由圖1可知，經過輻照處理后，4種溶劑中STC的降解效果明顯，并且趨勢相同，其降解率均隨著輻照劑量的增大而增大。當輻照劑量為3 kGy時，STC的降解速率依次為水＞氯仿＞乙腈＞甲醇，其降解率分別為99.52%、95.60%、84.54%和50.57%。當輻射劑量為6 kGy時，乙腈和水中STC的降解率相近，且均高于氯仿和甲醇。當輻射劑量大于6 kGy時，乙腈、水和氯仿中STC的降解率相近，且甲醇中STC降解率也相對增加。

2.2 不同起始濃度對STC輻照降解效果的影響

將 50、100 μg/L 和 200 μg/L 3 個不同濃度的 STC進行輻照處理，研究STC不同濃度對γ射線輻照降解效果的影響，結果見圖2。

圖2 不同初始濃度對柄曲霉素降解率的影響Fig.2 Effect of different initial concentration on sterigmatocystin degradation rate

由圖2中可以看出，當輻射劑量為3 kGy和6 kGy時，STC的初始濃度越低，其降解率越高，即初始濃度為50 μg/L的STC降解率明顯高于濃度為100 μg/L和200 μg/L。當輻照劑量高于6 kGy時，3種不同初始濃度的STC溶液的降解率基本一致，均接近100%。

3 討論

水經過輻照后會產生3種自由基，即還原性極強的H·、氧化性極強的·OH和水合電子e-aq，這3種自由基可加速有機化合物的降解[12]。本試驗中研究了4種不同溶劑中STC的輻照效果，發現不論輻照劑量大小，水溶液最利于STC的降解[13]。與該研究結果相類似，李萌萌等研究發現赤霉病麥粒徑經水浸泡后可顯著提高脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）的降解率，當劑量為10 kGy時，其降解率可達55.76%[14]。其次，毒素的初始濃度和輻照劑量均會影響毒素降解的效果，當輻照劑量一定時，溶液中水受到輻照所產生的活性自由基數目一定，因此較低濃度的毒素溶液與水產生的自由基碰撞的幾率高于高濃度的毒素溶液，降解率提高[15]。

真菌毒素最易污染谷物，因此輻照對谷物中真菌毒素的降解效果以及對谷物品質的影響成為了研究的重點。研究發現60Co-γ射線可有效降解谷物中的AFB1、玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A，且輻照后玉米中粗脂肪、粗蛋白含量、水分含量以及粗纖維含量均沒有顯著變化[15-17]。目前多數研究均發現輻照處理對去除食品中真菌毒素效果明顯[18-19]，但是仍有部分研究指出該方法效果不明顯。Jalili等研究了γ射線對黑胡椒中真菌毒素的降解效果，結果發現當輻射劑量低于10 kGy時，樣品中真菌毒素的含量并未降低，作者分析可能是由于胡椒含水量較低所致[20]。1970年，Aibara等報道輻射劑量高達182 kGy時，對干物質中AFB1的降解率并未超過10%[21]。Hooshmand等在研究中也發現，即使采用20 kGy的γ射線進行輻照，小麥、玉米和大豆中的AFB1也并未受到顯著性影響[22]。類似地，用劑量為25 kGy的γ射線對裝在薄聚乙烯袋中的花生粕進行輻照，樣品中AFB1的含量并未出現顯著性降低[23]。

作為AFB1的合成前體物質，STC在AFB1含量較高的食品中被頻繁檢出。同時，STC也是某些真菌的次級代謝終產物，當食品被這類真菌侵染時，一旦環境條件適宜，便會代謝生成有毒STC，威脅人類健康。因此，如何有效控制STC污染以及污染后如何去除成為以后的重點研究方向。

4 結論

60Co-γ射線可不同程度地降解溶液中的STC，不同輻照劑量對不同溶劑的降解速率的影響不同，且降解率隨著輻照劑量的增大而增加。當輻照劑量為3 kGy時，水溶液最有利于STC的降解，氯仿次之。當輻射劑量大于6 kGy時，水、乙腈和氯仿中STC的降解率相近，甲醇中STC降解率也相對增加。在同一輻照劑量下，柄曲霉素的初始濃度越低，其降解率越高。