一種席夫堿熒光探針的合成及對Zn2+選擇性識別

宋麗雪， 姚媛君， 董 川， 韓 輝*， 王 麗*

(1.山西大學化學化工學院,山西太原 030006；2.山西大學環境科學研究所,山西太原 030006)

組成人體的元素有60多種，而鋅在人體內的含量約為0.004%，是僅次于鐵的第二大微量元素[1,2]。Zn2+在基因表達、金屬酶調節、DNA合成和細胞新陳代謝等多種生理過程中均起著重要作用[3 - 5]。研究發現過量的排放含鋅污染物，會對環境造成危害，同時也會危害人們健康。土壤中含有過量Zn2+會使微生物活性降低，進而對環境造成不良影響。如果人體內Zn2+代謝紊亂，會導致多種疾病，如糖尿病、阿爾茨海默病、帕金森氏病、癲癇癥和肌萎縮等，因此對Zn2+的定量檢測具有重要意義。在眾多的分析方法中，熒光光譜法因其簡便、快速、靈敏等優點，而受到科研工作者的關注，并顯示出巨大的潛在應用價值[6 - 8]?？紤]到Zn2+對人體健康的潛在影響，所以新型高選擇性、高靈敏度的Zn2+熒光探針設計與合成仍具有重要的意義。

席夫堿類熒光探針由于其合成條件溫和，具有良好的配位能力，現已被廣泛應用于多種金屬離子的分析檢測中，如Mg2+、Hg2+、Al3+、Cu2+等[9 - 14]。本文以9-芴基甲基肼基甲酸酯和對甲基苯酚為原料，設計并合成了一種結構簡單的席夫堿熒光探針DHS。該熒光探針DHS在乙醇體系中，可以實現對Zn2+的選擇性識別。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Thermo Scientific Q Exactive高分辨液/質聯用儀(美國，賽默飛世爾科技公司)；PTI QuantaMasterTM400穩態/瞬態熒光光譜儀(美國，PTI公司)；Agilent Cary 8454紫外-可見分光光度計(美國，安捷倫科技有限公司)；Hei-VAP旋轉蒸發儀(德國，海道夫公司)；Bruker Avance Ⅲ HD 600 MHz超導核磁共振波譜儀(瑞士，布魯克科技有限公司)。

9-芴基甲基肼基甲酸酯(98.0%)，氘代二甲基亞砜(99.8 atom% D)，4-甲基苯酚(99.0%)，三氟乙酸(99.0%)等均購買于北京伊諾凱科技有限公司；無水乙醇、二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯均為分析純，購買于天津市富宇精細化工有限公司。實驗用水為ELGA純水機PURELAB Ultra制備的超純水。

1.2 探針DHS的合成

將對甲基苯酚(1.06 mL，10.0 mmol)與六亞甲基四胺(2.80 g，20.0 mmol)溶于10.0 mL三氟乙酸(TFA)中，然后在氮氣下加熱回流12 h。反應結束后，冷卻至室溫，加入210 mL 4.00 mol/L HCl，冰浴條件下攪拌24 h，用二氯甲烷萃取，加入無水MgSO4干燥，減壓蒸餾除去溶劑，殘余物用硅膠柱快速分離純化(乙酸乙酯∶石油醚=1∶19，V/V)，得到白色固體，即為2,6-二甲?；?4-甲基苯酚a(0.328 g，20.0%)。表征結果如下：1H NMR(600 MHz,CDCl3),δ(ppm):11.45(s,1H),10.22(s,2H),7.77(s,2H),2.39(s,3H)。13C NMR(151 MHz,DMSO-d6),δ(ppm):192.27,160.34,137.34,129.28,123.28,19.54。

將9-芴基甲基肼基甲酸酯(152 mg，0.600 mmol)與2,6-二甲?；?4-甲基苯酚a(98.4 mg，0.600 mmol)溶于10.0 mL二氯甲烷中，回流30 min。冷卻至室溫，過濾得到白色固體，用甲醇沖洗，干燥，即為探針DHS(0.115 g，30.0%)。表征結果如下：1H NMR(600 MHz,DMSO)δ11.73(s,1H),11.48(s,2H),8.29(s,2H),7.92(d,J= 7.4 Hz,4H),7.74(s,4H),7.43(t,J= 7.4 Hz,6H),7.35(t,J= 7.4 Hz,4H),4.54(s,4H),4.32(s,2H),2.27(s,3H)。HRMS(ESI):C39H32O5N4for [DHS+H]+,計算值為637.2373,測定值為637.2157。

探針DHS的合成路線如圖1所示。

圖1 DHS的合成路線Fig.1 Synthesis of probe DHS

2 結果與討論

2.1 DHS和DHS-Zn2+體系的光譜特性

首先考察了DHS在無水乙醇體系中與Zn2+的絡合性能。DHS在271 nm、392 nm處有2個吸收峰。加入Zn2+后，392 nm處的吸收峰紅移至412 nm。隨著溶液中加入的Zn2+濃度逐漸增大，412 nm處的吸收峰逐漸增強(圖2a)，說明DHS和Zn2+形成了新的配合物。并且在365 nm的紫外燈下，熒光顏色從紅色變為黃色。

圖2 DHS紫外吸收光譜(a)和熒光發射光譜(b)隨Zn2+濃度的變化 Fig.2 UV absorption spectra(a) and fluorescence spectra(b) of DHS in absolute ethanol with the presence of Zn2+ at different concentrations

實驗進一步研究了DHS和Zn2+配位后熒光光譜的變化(圖2b)。以420 nm為激發波長，DHS在630 nm處有發射峰，加入Zn2+后，630 nm處的發射峰藍移至530 nm處。隨著溶液中加入的Zn2+濃度逐漸增大，530 nm處的熒光強度顯著增強。加入Zn2+后，DHS溶液的吸收和發射光譜均發生明顯的變化，為建立熒光分析法提供了基礎。

熒光滴定實驗表明，在一定范圍內隨著Zn2+濃度的增加，DHS -Zn2+體系熒光強度逐漸增強。體系在530 nm處的熒光強度I530nm與Zn2+的濃度在4.00×10-6～3.60 ×10-5mol/L范圍內呈現良好的線性關系。由此可以實現探針DHS對Zn2+的定量檢測，檢測限(3S/N)為2.36×10-8mol/L。

2.2 DHS對Zn2+的選擇性和抗干擾性能研究

在相同實驗條件下，測定了DHS對不同金屬離子(Ag+、Ba2+、Ca2+、Cd2+、Hg2+、K+、Li+、Mg2+、Mn2+、Na+、Fe3+、Cu2+、Al3+、Zn2+)的熒光響應。如圖3a所示，只有加入Zn2+后，DHS在630 nm處的發射峰會藍移至530 nm處，并且伴隨著明顯的熒光顏色變化，由紅色變為黃色，表明DHS可以選擇性的與Zn2+結合，導致熒光發射藍移。此外，還考察了DHS作為熒光傳感器檢測Zn2+的抗干擾性，發現共存離子Cu2+對Zn2+具有干擾作用，通過加入掩蔽劑Na2S可以除去Cu2+的干擾，在干擾實驗中，除在Cu2+的溶液中加入7.2×10-5mol/L的Na2S掩蔽劑外，其余金屬離子的實驗條件均相同，結果表明其它離子對DHS -Zn2+體系的熒光強度不產生影響。因此，DHS可以選擇性的識別檢測Zn2+，且在Zn2+的檢測中有較好的抗干擾能力。 結果見圖3b。

圖3 (a)DHS對金屬離子的選擇性實驗；(b)加入掩蔽劑Na2S后DHS對金屬離子的干擾性實驗 Fig.3 (a) Fluorescence spectra of DHS(4.0×10-6 mol/L) in the presence of various metal ions(3.6×10-5 mol/L) in anhydrous alcohol.Inset:Fluorescence color change of DHS in the presence of Zn2+ under UV light;(b) With masking reagent Na2S9H2O,the fluorescence intensity of DHS(4.0×10-6 mol/L) at 530 nm upon addition of Zn2+ in the presence of interfering metal ions in anhydrous alcohol

2.3 結合模式

圖4 DHS-Zn2+在乙醇中的高分辨質譜(ESI-HRMS)圖Fig.4 ESI-HRMS of DHS -Zn2+ complex recorded in EtOH

在乙醇溶液中固定探針和Zn2+的總濃度為4.00×10-5mol/L ，通過等摩爾連續變化法，利用熒光強度變化測定希夫堿探針DHS與Zn2+的絡合比。當DHS與Zn2+的濃度比為1∶1時，體系DHS-Zn2+熒光強度達到最大值，由此可知DHS與Zn2+的絡合比為1∶1。通過高分辨質譜(圖4)測定配合物的分子離子峰，峰值m/z701.15168為DHS+Zn2++2H+[calculated,m/z:701.1586]，進一步證明了DHS與Zn2+以化學計量比1∶1結合。此外，依據Benesi-Hildebrand方程計算可知探針DHS與Zn2+的結合常數為8.09×104L/mol，該數值表明在溶液中探針DHS與Zn2+有很強的鍵合能力。

圖5 Zn2+對探針DHS核磁信號的影響Fig.5 1H NMR spectra of DHS and DHS with ZnCl2 in DMSO -d6:(a) DHS;(b) DHS+Zn2+(5 equiv.)

2.4 機理探討

通過核磁滴定實驗進一步確認配體DHS與Zn2+的配位情況，如圖5a所示，從配體的氫核磁譜圖上，可以看到在7.92、11.48、11.73處的峰，它們分別對應于-CH=N,-OH和-C=NH的氫核磁信號。當Zn2+加入后(圖5b)，化學位移在11.48處的苯羥基氫核磁信號逐漸降低，這可能是因為配體與Zn2+的相互作用導致去質子化；另外在7.92和11.73處的氫核磁信號相比于配體上對應信號有著不同程度的向低場移動，這表明碳氮雙鍵的氮原子和羰基上的氧原子參與絡合配位，而且當加入Zn2+后在6.28處出現新的峰。因此通過對比加入Zn2+前后的核磁譜圖的變化，再結合ESI-MS和Job曲線分析，可以得出結論，Zn2+與配體通過苯羥基氧原子，碳氮雙鍵的氮原子，還有羰基上氧原子配位形成了1∶1的配合物[15 - 17]，其可能的結合模式如圖6。

圖6 探針DHS和鋅離子可能的結合模式Fig.6 Proposed binding mode of probe DHS with Zn2+

3 結論

本文以對甲基苯酚為原料，利用Duff反應和縮合反應，設計合成了一種熒光增強型檢測Zn2+的席夫堿類熒光探針DHS，并通過核磁和高分辨質譜對探針結構進行了表征。等摩爾連續變化法和高分辨質譜實驗表明，DHS與Zn2+以1∶1絡合，核磁滴定實驗進一步證明了配體DHS與Zn2+的結合模式。熒光滴定實驗表明該探針DHS對Zn2+的識別具有較高的靈敏度，檢出限為2.36×10-8mol/L，有望發展分子探針DHS用于定量檢測微量Zn2+。