高效液相色譜-串聯質譜測定大鼠腦組織中D -絲氨酸和L-絲氨酸的含量

王 穎， 張 勇， 何 婷， 陳榮祥*

(1.遵義醫科大學醫學與生物學研究中心，貴州遵義 563000；2.遵義醫科大學藥學院，貴州遵義 563000；3.遵義市理化分析測試工程技術研究中心，貴州遵義 563000)

氨基酸類化合物廣泛存在于生物體內，它們對于調節機體的細胞代謝，疾病預防，疼痛調節等生理活動具有重要作用。大部分氨基酸有D -型和L-型兩種對映體，其中L-氨基酸是構成天然蛋白質的底物和生物體內重要的能源構成成分。D -型氨基酸在動物體內也廣泛存在并具有不同于L-氨基酸的生理功能[1 - 3]。其中D -絲氨酸(D -serine，D -Ser)是中樞神經系統中N-甲基-D -天冬氨酸受體的信號分子，由絲氨酸消旋酶對L-Ser的對映體轉化而來，D -Ser的濃度與許多中樞神經系統疾病尤其是疼痛密切相關。如降低大鼠頭端前皮層內源性D -Ser濃度可減輕疼痛相關的負性情緒[4]，在創傷及外周炎癥刺激下，星形膠質細胞被激活并釋放大量D -Ser會進一步導致促痛效果[5,6]。目前，基于絲氨酸消旋酶活性和表達的抑制或增強而引起的內源性D -Ser水平的變化是目前神經科學領域研究的熱點，因此，研究并建立D -Ser的準確高效的測定方法對神經科學、臨床醫學、疾病診斷及控制等具有重要意義。

生物樣品基質復雜且氨基酸大多不具有紫外或熒光信號，常需借助衍生化技術將其衍生后再進行分離檢測[7]。常用的有高效液相色譜法[8]、毛細管電泳法[9]等。但這些方法普遍存在分析時間長、操作繁瑣以及肽和胺類物質的干擾等缺點。近年來，高效液相色譜-串聯質譜法(HPLC-MS/MS)由于其高靈敏度、選擇性好、低檢測限等優點，已被廣泛應用于復雜基質中痕量組分的分析測定。采用HPLC-MS/MS測定D -氨基酸，可以直接采用手性色譜柱進行分離[10,11]，或者采用手性衍生試劑衍生化后分離[12]。采用衍生化的方式，不僅有利于手性異構體的分離，而且可以提高離子化效率，增加其在反向色譜柱中的保留，消除內源性干擾[13]。用于D -，L-氨基酸分離的衍生化試劑有(S)-(+)-4-(N,N-二甲氨基磺酰)-7-(3-異硫氰酸基吡咯烷-1-基)-2,1,3-苯并惡二唑[14]、Marfey試劑[15]、(S)-NIFE[12]等。但這些衍生化方法普遍存在試劑昂貴，衍生步驟繁瑣等缺點。

鄰苯二甲醛(OPA)結合N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)是液相色譜中，常用于熒光檢測的手性衍生試劑，其衍生方法簡單快速。然而生物體內氨基酸種類繁多，采用液相色譜分離干擾嚴重，分離困難。串聯質譜在多重反應監測(MRM)模式下可以通過兩次離子選擇，有效排除其他氨基酸干擾，其靈敏度、準確度均優于光學檢測器。本文利用該衍生試劑對D -Ser、L-Ser進行柱前衍生化，采用高效液相色譜分離，串聯質譜法檢測，建立了快速靈敏的D -Ser、L-Ser檢測方法，并用于痛覺模型大鼠不同腦區D -Ser、L-Ser的含量的測定。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

I-class-TQ-S超高效液相色譜-三重四極桿質譜儀(美國，Waters)；ME-104電子天平(梅特勒-托利多)；FE-28 pH計(梅特勒-托利多)；SB-800DTD型超聲清洗儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)；Microfuge-20型超高速離心機(貝克曼庫爾特商貿(中國)有限公司)。

D -Ser、L-Ser、L-刀豆氨酸(L-CAN)、OPA、NAC，均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，純度大于98%。甲醇為質譜純，購于霍尼韋爾貿易(上海)有限公司。NH4Ac為質譜純，硼砂為分析純，均購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。實驗用水由純水超純水系統(Purelab Chorus 2，英國埃爾格)制備。

1.2 標準品儲備液和衍生溶液的配制

標準品儲備液的配制：分別準確稱取D -Ser、L-Ser、L-CAN標準品10 mg，用水溶解并定容至10 mL，制得濃度為1 mg/mL的儲備液。其中L-CAN為內標。

衍生溶液的配制：分別稱取OPA 15 mg和NAC 100 mg，溶于1 mL甲醇，加入4 mL 0.1 mol/L硼砂緩沖液(pH=10.0)混合均勻，4 ℃儲存備用。使用前加0.1 mol/L硼砂緩沖液(pH=10.0)稀釋至所需濃度作為工作液。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物實驗成年SD大鼠12只，雄性，體重220～250 g，購于長沙市天勤生物技術有限公司(合格證號：SCXK(湘)2014-0011)。所有大鼠在安靜、溫度24±1 ℃、濕度60±5%、12 h明/12 h暗光照環境中飼養。首先建立雙側坐骨神經結扎(CCI)痛覺模型，12只大鼠隨機分為：A:對照組，B:CCI+生理鹽水組。實驗開始時，CCI組大鼠于右后肢縱向切開皮膚，鈍性分離，暴露坐骨神經主干，絲線間斷結扎，間距1 mm，松緊度以小腿肌肉出現輕微震顫為標準，生理鹽水沖洗后逐層縫合，術后予腹腔注射1 mL生理鹽水(NS)。

1.3.2 樣品處理和衍生化反應用異氟烷麻醉大鼠后立即斷頭處死，迅速取出腦組織并在冰上分離出額葉、頂葉、顳葉、海馬、紋狀體，按照每0.1 g腦組織加入1.5 mL的HCl(0.02 moL/L)，冰浴下勻漿，12 000 r/min離心10 min，取上清液，按照體積比1∶3 加入乙腈沉淀蛋白。12 000 r/min離心10 min，取90 μL離心后的上清液，加10 μL內標(10 μg/mL L-CAN)，20 μL衍生試劑和1 080 μL水，渦旋混合反應3 min后進樣。衍生化反應如圖1所示。

圖1 D -Ser、L-Ser與OPA的衍生化反應Fig.1 Derivative reaction of D -Ser,L-Ser with OPA

1.4 色譜和質譜條件

色譜柱：Waters XBridge BEH C18柱(150 mm×3 mm，2.5 μm)；流動相：13 mmol/L NH4Ac溶液(A)-甲醇(B)。梯度洗脫：0～5 min，5%～20%B；5～8 min，20%～42.5%B；8～10 min，42.5%～90%B；10～11 min，90%B；11～11.5 min，90%～5%B；11.5～15 min，5%B。體積流量：0.4 mL/min；柱溫：40 ℃；自動進樣器溫度為4 ℃；進樣量：5 μL。

電噴霧電離源，采用正離子模式(ESI+)；掃描方式為MRM；毛細管電壓：3.5 kV；溫度：450 ℃；氣流量：750 L/h。

2 結果與討論

2.1 衍生條件的優化

圖2 衍生化前色譜圖(HILIC色譜柱)Fig.2 Chromatogram of D,L-Ser without derivatization(HILIC column)

采用液相色譜法分離D -Ser和L-Ser存在諸多困難。首先，氨基酸極性很強，在反相色譜柱中難以保留，通常需要在流動相中添加離子對試劑，但這會嚴重影響質譜性能，降低其負離子模式下的響應。采用HILIC色譜柱可以增加氨基酸的保留時間，但是D -Ser和L-Ser保留時間一致，無法分離，如圖2所示。目前拆分D -Ser和L-Ser需要采用手性色譜柱或者手性衍生試劑進行衍生化。例如，Kohnosuke Kinoshita等采用CROWNPAK CR(+)色譜柱，在流動相中添加三氟乙酸分離D -Ser和L-Ser[11]。但是該方法D -Ser和L-Ser的容量因子較低，基質效應嚴重，需要采用昂貴的同位素內標進行定量。

圖3 衍生試劑OPA濃度的優化Fig.3 Optimization of the concentration of OPA

OPA被廣泛應用于氨基酸對映體的光學拆分，在堿性環境中，在手性硫醇化合物如NAC或N-叔氧羰基-L-半胱氨酸存在下，OPA容易與伯胺發生反應，生成非對映異吲哚衍生物[16]。一般選擇衍生試劑的pH值為9.5～10.5，室溫下混合反應3 min即可反應完全[17]。實驗中，取目標腦區樣品按照上述“1.3.2”項的方法對樣品進行前處理，取同等體積樣品分別加入濃度為0.002、0.004、0.01、0.02、0.04、0.06、0.1、0.2、0.4 mg/mL的衍生試劑并在室溫下反應3 min，過濾后進樣，根據峰面積的變化來選擇最佳的衍生試劑濃度(圖3)。結果顯示當衍生試劑的濃度為0.06 mg/mL時衍生產物峰面積已到最大，繼續增加衍生試劑的用量峰面積保持穩定。為保證衍生反應完全進行，選擇衍生試劑的濃度為0.1 mg/mL。

2.2 質譜條件的優化

一般情況下，含氮化合物在正離子模式下信號較強，因此我們采用了正離子模式監測。通過全掃描模式獲得氨基酸衍生物的母離子，在選擇離子檢測模式下優化其錐孔電壓。繼續在產物離子掃描模式下獲得產物離子，響應強的產物離子作為該物質的定量離子，在MRM模式下優化了碰撞能量。3種目標氨基酸衍生產物的質譜檢測參數見表1，D -Ser、L-Ser和L-CAN衍生產物的二級質譜譜圖見圖4。

表1 目標氨基酸衍生產物的質譜分析參數

圖4 D -Ser、L-Ser(a)和L-CAN(b)的二級質譜圖Fig.4 MS2 of D -Ser，L-Ser(a)and L-CAN(b)

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系和檢測限配制濃度為0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 μg/mL的D -Ser和L-Ser 系列濃度標準溶液，加入等體積OPA-NAC衍生化試劑，充分反應，進樣檢測，記錄色譜圖。以標準品與內標物(L-CAN)的濃度之比為橫坐標(x)，以標準品與內標物的峰面積之比為縱坐標(y)作回歸曲線，分別得D -Ser和L-Ser異構體衍生物的回歸方程為:y=0.1745x-0.0027(R2=0.9997)，y=0.1461x-0.0166(R2=0.9996)。結果表明D -Ser、L-Ser的檢測濃度在0.01～2 μg/mL范圍內具有良好的線性關系。以3倍信噪比計算檢測限，D -Ser、L-Ser的檢測限分別為0.4 ng/mL和0.5 ng/mL。而采用非衍生化的方式，D，L-Ser的檢測限均為15 ng/mL，可見衍生化不僅有利于二者的分離，而且檢測靈敏度也得到提高。

2.3.2 穩定性OPA衍生方法的一個重要缺陷是衍生產物不穩定，以往的研究表明在低溫下可以增加產物的穩定性[18]。將進樣器的溫度設置為4 ℃，在0.1～12 h的范圍內以峰面積評定產物的穩定性，結果表明在4 ℃條件下，產物在12 h內穩定。

2.3.3 回收率分別添加不同濃度水平的D -Ser、L-Ser標準品至腦組織提取液中進行加標回收實驗，每個濃度5個樣品，計算方法回收率，結果見表2。D -Ser、L-Ser平均加樣回收率分別87.63%～94.00%和90.93%～99.56%，相對標準偏差(RSD)小于7.82%。

表2 腦組織中D -Ser和L-Ser的回收率(n=5)

2.3.4 精密度取腦組織提取液衍生化后進樣測定，連續進樣6次，記錄檢測出的D -Ser、L-Ser的衍生物峰面積值，計算得峰面積值的RSD分別為1.60%、1.30%。結果表明儀器的精密度良好。

2.3.5 基質效應由于D -Ser、L-Ser在動物體內普遍存在，缺乏空白基質，因此我們通過比較在大鼠腦組織提取液中加入標準溶液繪制標準曲線獲得的斜率和在標準溶液中獲得的斜率來確定基質效應?；|效應(%)=大鼠腦組織提取液中的平均斜率/標準溶液中的平均斜率×100%。本實驗中，D -Ser、L-Ser、L-CAN的基質效應分別為106.11%、109.34%、110.20%，基質效應不顯著。

2.4 方法學應用

應用上述方法對12只成年大鼠不同腦區進行處理后測定，D -Ser的保留時間為4.66 min，L-Ser的保留時間為4.83 min，供試樣品溶液中被測組分的色譜峰達到較好分離，結果見圖5。采用上述方法對對照組和疼痛模型組大鼠不同腦區中D -Ser、L-Ser的含量進行了測定，結果見表3。結果表明，疼痛模型組和對照組比較，在額葉、頂葉、海馬等腦區D -Ser、L-Ser的含量無明顯差異，在顳葉中D -Ser和L-Ser的含量均有顯著性的下降(p<0.01)。在紋狀體內D -Ser和L-Ser含量增加(p<0.05)。疼痛組和對照組顳葉、紋狀體中D -Ser與L-Ser濃度的比值存在顯著差異(p<0.05)。因而，腦組織中D -Ser與L-Ser濃度有可能作為神經系統疾病的診斷指標。

圖5 3種氨基酸標準品(A)和生物樣品(B)色譜圖Fig.5 Chromatograms of the standard solution (A) and brain tissues sample (B)

表3 不同腦區D -Ser、L-Ser濃度(n=6)

3 結論

本研究建立了OPA柱前衍生化，HPLC-MS/MS法測定大鼠腦組織中D -Ser、L-Ser的方法，該方法靈敏、快速、專屬性好，檢測時間短。經方法學驗證該方法精密度、穩定性、線性關系、加樣回收率均良好，適用于腦組織中D -，L-Ser快速同時檢測，對于疼痛相關神經系統疾病的進一步研究提供方法學參考。