攪拌棒吸附萃取-液相色譜-串聯質譜法測定農業廢水中二氯吡啶酸殘留量

王雪平， 耿 悅， 朱惠斌*

(1.黃河水利職業技術學院，河南開封 475004；2.開封市綠色涂層材料重點實驗室，河南開封 475004)

二氯吡啶酸(Clopyralid)，又名3,6-二氯吡啶-2-羧酸、3,6-二氯吡啶羧酸，商品名畢克草Ⅱ號(CAS號1702-17-6)，是一種人工合成的擬植物激素型除草劑，屬內吸性農藥，施藥后會很快被雜草葉片、根部吸收，并傳遞到全株各部位。其除草作用機理為促進雜草DNA、RNA和蛋白質的合成，致使根部生長過量、莖及葉生長畸形、養分消耗，維管束輸導功能受阻，導致雜草死亡，可徹底殺死敏感深根雜草[1 - 3]。二氯吡啶酸已成為農業廢水中新型污染物，若過量濫用，二氯吡啶酸可通過多種途徑污染土壤、水體，從而引發對非靶標植物、動物繁殖、植物群落等一系列問題[4 - 7]。歐盟規定飲用水中單個農藥的殘留量≤0.1 mg/kg；我國國家標準(GB 2763-2016)《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》中規定，小麥、玉米、油菜籽中二氯吡啶酸最大殘留量分別為2、1、2 mg/kg，但尚未制訂水中二氯吡啶酸殘留限量和分析方法。因此，建立高效、準確的水中二氯吡啶酸殘留量檢測方法具有重要意義。

目前關于二氯吡啶酸測定方法主要有高效液相色譜法[8 - 10]、氣相色譜法[11,12]、液相色譜-質譜法[13]，分析對象大多為二氯吡啶酸原藥及其水溶性粒劑、油菜、土壤、植物源性食品等，而關于農業廢水中二氯吡啶酸殘留量檢測報道較少。攪拌棒吸附萃取(Stir Bar Sorptive Extraction,SBSE)是一種新型固相微萃取樣品前處理技術[14,15]，該技術具有萃取容量高、無需外加攪拌子、可避免競爭性吸附、操作簡便等特點，在痕量物質分析中具有廣闊的應用前景。本文在優化攪拌棒吸附萃取條件和液相色譜-質譜法參數的基礎上，建立了SBSE-液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)測定農業廢水中二氯吡啶酸殘留量，以期為農業廢水中二氯吡啶酸殘留監控提供檢測方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

ACQUITY型超高效液相色譜儀(美國，Waters公司)；Xevo TQ MS型三重四極桿質譜儀(美國，Waters公司)；Milli-Q超純水器(美國，Millipore公司)；ME204E電子分析天平(瑞士，Mettler公司)；Vortex-Genie 2型渦旋振蕩器(美國，Scientific Industries公司)；AVANTI J-15型高速冷凍離心機(美國，Beckman Coulter公司)；SKY-211D型恒溫培養振蕩器(江蘇盛藍儀器制造有限公司)；TTL-DC氮吹儀(北京同泰聯科技發展有限公司)；攪拌棒(德國，Gerstel公司)，棒長10 mm，聚二甲基硅氧烷(PDMS)膜厚0.5 mm，萃取相涂層25 μL。

二氯吡啶酸標準品(純度98%，美國A Chemtek Inc.公司)。二氯吡啶酸標準儲備液：準確稱取適量的二氯吡啶酸標準品，用乙腈配制成質量濃度為100 mg/L的標準儲備液。使用時用初始流動相進行稀釋，現用現配。甲醇、乙腈為色譜純；NaCl、HCl均為分析純。實驗用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

色譜條件：UPLC BEH C18色譜柱(150 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動相A為0.1%甲酸溶液，B為乙腈；流動相梯度洗脫程序：0～2.0 min,90%～30%A;2.0～4.0 min,30%～10%A;4.0～4.1 min,10%～90%A;4.1～10.0 min,90%A。流速0.2 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量3 μL。

質譜條件：電子轟擊電離源(EI)；負離子掃描；毛細管電壓3.5 kV；離子源溫度150 ℃；干燥氣溫度450 ℃；干燥氣流速600 L/h；碰撞氣氬氣，流速0.15 mL/min。二氯吡啶酸多反應監測(MRM)模式條件：定性離子對m/z189.9/35.1；定量離子對m/z189.9/146.1；錐孔電壓18 V；碰撞能量10 eV。

1.3 樣品前處理

準確移取10 mL樣品，置于50 mL離心管中，加入PDMS攪拌棒，控制NaCl質量濃度為100 g/L；在溫度20 ℃下，以100 r/min攪拌萃取30 min；加入甲醇10 mL，以100 r/min振蕩解吸30 min，解吸液在45 ℃ 氮吹濃縮近干，加入初始流動相溶解并定容至1 mL，過0.22 μm有機相微孔濾膜，濾液待測。

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優化

圖1 二氯吡啶酸二級質譜圖Fig.1 Secondary mass spectrum of clopyralid

圖2 二氯吡啶酸標準溶液總離子流色譜圖Fig.2 Total ion current chromatogram of clopyralid standard solution

以蠕動泵直接進樣，將1.0 μg/mL二氯吡啶酸標準溶液連續注入電子轟擊電離源中，分別采用正離子模式或負離子模式對二氯吡啶酸進行質譜分析。結果表明：采用負離子模式時，可獲得質荷比(m/z)為189.9的高豐度[M-H]-準分子離子峰，這可能與二氯吡啶酸分子結構中羧基易失去H有關；以準分子離子峰為母離子進行子離子掃描，并在MRM模式下優化碰撞能量和錐孔電壓，獲得的二級碎片離子主要為m/z35.1、74.1、92.0、146.1(圖1)，其中m/z35.1信號最穩定，m/z146.1信號最強，因此選擇m/z35.1為定性離子，選擇m/z146.1為定量離子。

2.2 色譜條件的選擇

分別考察色譜柱的類型(Diamonsil C18、Zorbox SB C18、Waters BEH C18、Shim-pack VP-ODS C18)，流動相的組成(甲醇/乙腈-水、甲醇/乙腈-0.1%甲酸溶液、甲醇/乙腈-5 mmol/L NH4Ac溶液)對二氯吡啶酸的色譜分離效果和離子化效率的影響。結果表明：采用Diamonsil C18、Zorbox SB C18、Shim-pack VP-ODS C18色譜柱時，二氯吡啶酸色譜峰較寬，出峰時間較長(6.82～8.74 min)，而Waters BEH C18色譜柱對二氯吡啶酸的出峰時間適中(5.32 min)、分離度好、靈敏度高、峰形對稱且尖銳。采用Waters BEH C18作為分析柱，以甲醇/乙腈-水或甲醇/乙腈-5 mmol/L NH4Ac溶液為流動相時，二氯吡啶酸峰形較差，出現基線漂移；以甲醇/乙腈和0.1%甲酸溶液為流動相時，色譜圖響應值較高，尤其有機相選擇乙腈時，色譜峰峰形更窄，且峰形尖銳對稱、分離效果最好，色譜分離情況見圖2。

2.3 攪拌棒萃取條件的優化

2.3.1 攪拌棒萃取影響因素分析以PDMS攪拌棒對農業廢水中二氯吡啶酸萃取率為考察指標，采用單一變量法分別研究萃取時間、萃取溫度、攪拌速率、pH值、離子強度對二氯吡啶酸的萃取效率的影響。結果表明：當萃取時間在10～30 min時，二氯吡啶酸萃取效率隨著萃取時間的延長而增高；當萃取溫度在30～50 ℃時，二氯吡啶酸萃取效率隨著萃取溫度的升高而降低；當攪拌速率在50～150 r/min時，二氯吡啶酸萃取效率隨著攪拌速率的增大而增高；離子強度可影響二氯吡啶酸在農業廢水和PDMS攪拌棒涂層中的分配系數，加入質量濃度為50～100 g/L NaCl，二氯吡啶酸萃取效率隨著攪拌速率的增大而增高；當農業廢水中pH值在5～8時，二氯吡啶酸萃取效率受pH值的影響較少。因此，影響PDMS攪拌棒對農業廢水中二氯吡啶酸萃取效率的因素主要為：萃取時間、萃取溫度、攪拌速率、離子強度。

2.3.2 正交試驗分析選取萃取時間(A)、萃取溫度(B)、攪拌速率(C)、離子強度(D)四個因素，選用3個水平，設計因素水平表(表1)，采用L9(34)正交試驗設計(表2)和方差分析(表3)進行PDMS攪拌棒萃取條件優化。

表1 正交試驗因素及水平

表2 L9(34)正交試驗設計及實驗結果

表3 方差分析表

從表3中可知，影響PDMS攪拌棒萃取條件的因素為；B>A>D>C；PDMS攪拌棒萃取最優條件為：A2B1C2D3，即PDMS攪拌棒萃取時間30 min，萃取溫度20 ℃，攪拌速率100 r/min，離子強度100 g/L。從表4中可知，萃取時間、萃取溫度、攪拌速率、離子強度對正交試驗無顯著性影響。

2.4 攪拌棒解吸條件的優化

分別考察了解吸液、解吸時間、解吸模式對PDMS攪拌棒對農業廢水中二氯吡啶酸解吸效率的影響。結果表明：甲醇對攪拌棒PDMS涂層吸附的二氯吡啶酸具有良好的解吸效果，解吸率可達98.6%；解吸時間在5～15 min范圍內，二氯吡啶酸的解吸率隨著時間的延長而增大，當解吸時間增加到30 min時，二氯吡啶酸的解吸率不再發生變化，趨于平衡；與靜態解吸模式相比，動態解吸模式經攪拌或振蕩能顯著提高甲醇溶劑傳遞，從而加速被攪拌棒吸附的二氯吡啶酸解吸。因此本實驗解吸條件選擇：采用動態解吸模式，以甲醇作為解析液，解吸時間30 min。

2.5 基質效應的影響

為避免農業廢水中非目標物對攪拌棒萃取二氯吡啶酸時產生干擾，采用標準加入法分析二氯吡啶酸在純乙腈和不含目標物的農業廢水中的基質效應(ME=B/A×100%，B為農業廢水基質中目標物質譜響應值，A為純乙腈基質中目標物質譜響應值)[16]。結果表明：在純乙腈和不含目標物的農業廢水兩種基質中分別加入終濃度為1.0 μg/L、25.0 μg/L、50.0 μg/L三種水平濃度的二氯吡啶酸標準溶液，按本文所建方法SBSE-液相色譜-質譜法測定二氯吡啶酸質譜響應值，經計算基質效應在92.1%～97.3%之間。這表明采用SBSE-液相色譜-質譜法測定農業廢水中二氯吡啶酸時，不存在基質效應。

2.6 線性范圍、檢出限與定量限

依次配制質量濃度為1.0、5.0、10.0、25.0、50.0 ng/mL二氯吡啶酸標準系列溶液，按本文所建立的方法進行測定，以二氯吡啶酸的質量濃度(x)為橫坐標，二氯吡啶酸的質譜響應值(y)為縱坐標，繪制標準曲線；對20份不含目標物的空白農業廢水樣品進行測定，以3倍信噪比(S/N=3)為檢出限，以S/N=10為定量限。結果表明：二氯吡啶酸質量濃度在1.0 ng/mL～50.0 ng/mL范圍內與其質譜響應值呈線性關系，線性回歸方程為：y=8127.3x+654.2，相關系數(r)為0.9998；檢出限為0.3 μg/L，定量限為1.0 μg/L。

2.7 加標回收率和精密度

隨機選取具有代表性的3種農業廢水，依次添加終濃度為1.0 ng/mL、25.0 ng/mL、50.0 ng/mL二氯吡啶酸標準，每個加標水平重復測定6次，按本文所建立的方法測定加標回收率和相對標準偏差(RSD)。結果見表4。從表4中可知：在1.0～50.0 ng/mL加標濃度范圍內，二氯吡啶酸平均加標回收率在87.8%～97.8%范圍，RSD在0.9%～4.7%之間。該方法準確度高、精密度好。

表4 回收率和精密度(n=6)

(續表4)

圖3 農業廢水樣品中二氯吡啶酸總離子流色譜圖Fig.3 Total ion current chromatogram ofclopyralid in agricultural wastewater

2.8 實際樣品的測定

采用本文所建立的SBSE-LC-MS/MS法，對30份實際農業廢水樣品進行二氯吡啶酸殘留量測定。結果表明：30份所檢測的農業廢水中，4份農業廢水檢出二氯吡啶酸，見圖3。陽性檢出率為13.3%，殘留量在8.3～257.2 μg/L之間；4份陽性農業廢水采集地附近為油菜、小麥種植區，二氯吡啶酸殘留可能是由于防除闊葉雜草而噴施含有二氯吡啶酸的除草劑引起的。

3 結論

本研究在優化攪拌棒吸附萃取條件和液相色譜-質譜法參數的基礎上，建立了SBSE-液相色譜-串聯質譜法測定農業廢水中二氯吡啶酸含量的分析方法。實驗結果表明該方法具有操作簡便、試劑消耗少、準確度高、檢出限低等特點，可為農業廢水中二氯吡啶酸含量監測提供檢測方法。