高效液相色譜法檢測食品中8種直接染料和6種合成色素

白 洋, 潘 城, 任小英, 胡朝陽, 謝 勇, 黃永輝, 黃何何

(國家加工食品質量監督檢驗中心(福州),福建省產品質量檢驗研究院，福建福州 350002)

直接染料即不需媒染劑的幫助便能夠染色的染料，主要應用于纖維、棉紡等行業,部分直接染料由于自身的偶氮結構使其具有致癌、致畸等毒副作用，因此在其應用上有著嚴格的限定，更不允許在食品當中使用。合成色素作為人工合成的產品，具有顏色多樣、著色力強的優點，在食品加工行業有著非常廣泛的應用，但是在其生產成過程中會帶入一定量的砷、鉛、銅、苯酚、苯胺、乙醚、氯化物和硫酸鹽等有害物質，對人體有著一定的危害。因此根據我國《食品添加劑使用衛生標準》[1],對合成色素的使用有著嚴格的規定。

隨著人們對生態環境以及食品安全的更加重視，染料以及合成色素的使用受到了越來越多的關注。其中由于直接染料已知的致癌致畸性[2 - 4]，近年來出現了大量關于染料的吸附以及降解方面[5 - 13]的研究，而食品中合成色素的使用也備受矚目[14 - 17]。因此，對于食品中非法添加的染料以及合成色素的檢測仍然應該是我們食品安全檢測的重點。

目前染料以及色素常見的檢測方法有液相色譜法[18 - 21]、毛細管電泳法[22]、液相色譜-質譜法[23 - 26]。其中，質譜法由于檢測成本較高，而毛細管電泳法在和紫外檢測器聯用時靈敏度較低，因此這兩種方法在日常篩查中難以普及。而液相色譜法具有較低的檢測成本、準確的定量分析以及較高的靈敏度等特點，使其在日常檢測中更加具有優勢。但是目前針對食品中染料檢測的液相色譜法通常只針對一種或少數幾種的染料以及色素進行檢測，覆蓋范圍相對較小。本文建立的同時高效、快速測定 8種直接染料直接黃23、直接紅28、直接紅81、直接藍6、直接藍1、直接黑38、直接黃12、直接黃26，以及檸檬黃、日落黃、胭脂紅、莧菜紅、誘惑紅、亮藍6種合成色素的分析方法，可以加大食品中非法添加著色劑的監測力度，為食品安全保障提供支持。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Waters 2695高效液相色譜儀(美國，Waters公司)；BSA224S電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司)；KQ-800KDE高功率數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Avanti J-E高速冷凍離心機(美國，貝克曼公司)；MS 3 basic單發渦旋振蕩器(德國，IKA公司)。

直接黑38(Direct black 38，純度98%)購自百靈威科技有限公司；直接藍1(Direct blue 1，純度100%)、直接黃12(Direct yellow 12，純度100%)、直接黃26(Direct yellow 26，純度100%)均購自梯希愛(上海)化成工業發展有限公司；直接藍6(Direct blue 6，純度100%)購自德國Dr.Ehrenstorfer公司；直接紅23(Direct red 23，純度99%)購自上海一研生物科技有限公司；直接紅28(Direct red 28，純度98%)購自德國CNW科技公司；直接紅81(Direct red 81，純度98%)購自山東西亞化學工業有限公司；檸檬黃(Tartrazine，濃度0.5 mg/mL)、日落黃(Sunset yellow，濃度0.5 mg/mL)、胭脂紅(Ponceau 4R，濃度0.5 mg/mL)、莧菜紅(Amaranth，濃度0.5 mg/mL)、亮藍(Brilliant blue，0.5 mg/mL)、誘惑紅(Allura red，1.0 mg/mL)購自中國計量科學研究院；乙腈、甲醇(色譜純，山東禹王實業有限公司)。

糖果、紅酒、飲料均為市售商品。

1.2 實驗條件

1.2.1 標準儲備液和標準工作溶液配制準確稱取適量的各化合物標準品(精確到0.01 mg)，用50%甲醇溶解并定容至100 mL，配制成濃度為70 mg/L到4 108 mg/L的混合標準品儲備液，用50%甲醇稀釋成0.035 mg/L到41.1 mg/L之間的系列標準工作溶液，置于冰箱中-4 ℃保存。

1.2.2 樣品前處理糖果類固體樣品稱取1.0 g(精確至0.0001 g)于燒杯中，加入一定量50%甲醇溶解，超聲30 min，隨后轉移至10 mL容量瓶中，待其冷卻后定容至刻度線，搖勻，過0.20 μm PTFE濾膜，供高效液相色譜上機分析。紅酒、飲料類液體樣品直接稱取1.0 g(精確至0.0001 g)于10 mL容量瓶中，加入一定量50%甲醇溶解，搖勻，過0.20 μm PTFE濾膜，供高效液相色譜上機分析。

1.2.3 儀器參數條件色譜柱：WondaCract ODS -2柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：A為乙腈，B為0.02 mol/L NH4Ac溶液；梯度洗脫程序：0～20 min，3%～30%A；20～30 min，30%～38%A；30～35 min，38%～60%A；35～35.1 min，60%～3%A；35.1～40 min，3%A。流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：20 μL；檢測波長：檸檬黃、直接黃12、直接黃26選擇400 nm作為檢測波長；日落黃、胭脂紅、莧菜紅、誘惑紅、直接黃23、直接紅28、直接紅81選擇508 nm作為檢測波長；亮藍、直接藍6、直接藍1、直接黑38選擇613 nm作為檢測波長。

圖1 8種直接染料和6種合成色素在乙腈-0.02 mol/L乙酸銨溶液體系下色譜圖Fig.1 Chromatograms of 8 kinds of direct dyes and 6 kinds of synthetic pigments under acetonitrile-ammonium acetate solutionPeaks:1.Tartrazine;2.Amaranth;3.Ponceau 4R;4.Sunset yellow;5.Allura red;6.Direct blue 6;7.Direct blue 1;8.Brilliant blue;9.Direct red 81;10.Direct red 23;11.Direct red 28;12.Direct yellow 26;13.Direct yellow 12;14.Direct black 38.

2 結果與討論

2.1 檢測波長的選擇

在實驗過程中，使用光電二極管陣列檢測器對14種標準樣品進行全波長掃描。根據其光譜圖并結合各化合物的響應靈敏度，本實驗分別選擇400 nm作為檸檬黃、直接黃12、直接黃26的檢測波長；選擇508 nm作為日落黃、胭脂紅、莧菜紅、誘惑紅、直接黃23、直接紅28、直接紅81的檢測波長；選擇613 nm作為亮藍、直接藍6、直接藍1、直接黑38的檢測波長。

2.2 流動相體系的選擇

實驗比較了乙腈-水溶液、乙腈-0.02 mol/L NH4Ac溶液兩種流動相體系。發現在乙腈-水溶液體系下，8種直接染料和6種合成色素的出峰效果和靈敏度極差；而乙腈-0.02 mol/L NH4Ac溶液體系，可以使8種直接染料和6種合成色素均有良好的峰形和分離效果，因而選擇乙腈-0.02 mol/L NH4Ac溶液體系進行下一步的實驗。圖1為8種直接染料和6種合成色素的混合標準溶液的色譜圖。

2.3 色譜柱的選擇

實驗比較了WondaCract ODS -2柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)和Ultimate XB-C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)對8種直接染料和6種合成色素的分離效果。當采用Ultimate XB-C18柱時，直接紅81和直接紅23保留時間幾乎一致，無法分離；而采用WondaCract ODS -2柱時，各化合物均有最好的分離效果，因此選用WondaCract ODS -2柱。

2.4 樣品前處理的優化

分別考察了甲醇、NH4Ac溶液、50%甲醇作為提取溶劑時對回收率以及化合物響應的影響。發現當甲醇作為提取溶劑時，檸檬黃幾乎沒有響應；當用NH4Ac和50%甲醇作為提取溶劑時各化合物的回收率均在95%以上，而50%甲醇作為提取溶劑時，直接黑38、直接藍6、直接藍1的靈敏度更高，因此選擇50%甲醇作為提取溶劑。

2.5 線性方程、線性關系、檢出限及定量限

配制系列混合標準溶液，根據相應的峰面積(Y)和對應的檢測濃度(X)制作標準曲線，如表1所示。各化合物在他們的濃度范圍內具有很好的線性關系，相關系數r大于0.9993，以3倍信噪比(S/N=3)時的質量濃度作為檢出限，10倍信噪比(S/N=10)時的質量濃度作為定量限，各化合物的檢出限均小于1.1 mg/kg，定量限小于3.2 mg/kg。

表1 8種直接染料和6種合成色素的線性方程、線性范圍、線性相關系數(r)、檢出限及定量限

2.6 回收率和精密度測定

在優化后的條件下，分別取樣品空白基質進行3個水平的加標回收實驗，每個水平重復分析6次，計算加標回收率和相對標準偏差，結果見表2。平均加標回收率為93.5%～99.6%，相對標準偏差(RSD)為1.3%～3.9%。表明該色譜分析方法適用于樣品中的8種直接染料和6種合成色素的日常分析檢測。

表2 空白樣品中8種直接染料和6種合成色素平均加標回收率及其相對標準偏差(n=6)

(續表2)

2.7 穩定性考察

取空白基質樣品進行3個水平的加標，并放置于室溫條件下，分別在0、4、8、12、24、48 h下進行測定，計算3個水平加標的RSD值分別為4.5%、3.9%、4.2%，表明樣品溶液在48 h 內具良好穩定性。

2.8 實際樣品測定

圖2 7號樣品色譜圖Fig.2 Chromatograms of sample 7

應用此方法對國內市售不同品牌的6種紅酒、10種飲料、4種糖果進行了測定。其中1號糖果檢出亮藍15 mg/kg；2號糖果檢出日落黃51 mg/kg；3號糖果檢出誘惑紅9.3 mg/kg；6號飲料檢出檸檬黃7.6 mg/kg；7號飲料檢出檸檬黃8.2 mg/kg、日落黃15 mg/kg；10號飲料檢出亮藍0.32 mg/kg、檸檬黃5.1 mg/kg；13號飲料檢出誘惑紅0.87 mg/kg、檸檬黃8.0 mg/kg。所有樣品均未檢出直接染料，且其合成色素含量均符合標準(GB 2760-2014)的規定。圖2為7號樣品實際色譜圖。

3 結論

本文建立了一種同時測定食品中8種直接染料和6種合成色素的高效液相色譜法。分別考察了不同色譜柱、流動相體系、前處理等因素對待測物分離效果的影響。該方法快速、靈敏度高、準確度高，可用于食品中8種直接染料和6種合成色素的同時分析檢測，為食品安全的檢測提供技術支持。