超高效液相色譜-串聯質譜法同時直接測定草甘膦和草銨膦及其代謝物

楊華梅， 杭 莉， 刁春霞*， 張雪梅

(泰州市疾病預防控制中心，江蘇泰州 225300)

草甘膦(Glyp)和草銨膦(Gluf)均為非選擇性、內吸附型的轉基因作物耐受除草劑，他們的使用量分別位于世界第一和第二的位置[1,2]，已被廣泛應用于農業生產中。我國是農業大國，草甘膦、草銨膦的生產和使用量都位居世界前列[3]。草甘膦通過干擾腸道細菌，抑制CYP酶類，以及影響硫酸鹽的運輸活動，可增加乳糜瀉、自閉癥譜系障礙、不孕不育癥、肥胖癥以及癌癥等臨床疾病的患病風險[4]。草銨膦因其可能會對哺乳動物和非目標節肢動物造成危害，歐盟委員會已于2013年11月13日開始限制草銨膦除草劑的使用[5]。另外有研究顯示草銨膦會造成人的DNA氧化性損傷[6]，在使用草銨膦的地區，通過飲食和飲水可對人體和動物造成危害[7 - 9]。草甘膦在環境中主要有氨甲基膦酸(AMPA)、N-乙酰氨甲基膦酸(N-Acely-AMPA)，他們具有與有機膦化合物類似的毒理作用[3]。草銨膦在環境中主要降解為3-甲基磷酸亞基丙酸(MPPA)。大量使用草甘膦和草銨膦必然會對土壤、水體及生物等造成極大的污染，并通過食物鏈的生物富集作用對人體產生潛在及長期的毒性[10]。因此，對草甘膦和草胺膦的檢測具有重要意義。

目前文獻報道較多的主要關于水中草甘膦及其氨甲基膦酸的測定，最常用的檢測方法有柱后衍生液相色譜法[10,11]、柱前衍生液相色譜法[12,13]、柱前衍生液相色譜-質譜聯用法[14]和液相色譜-質譜聯用直接測定法[15]。但草甘膦與草銨膦及其代謝物同時檢測的方法報道很少[12,16]。本文采用超高液相色譜-串聯質譜法(UPLC-MS/MS)同時測定水中草甘膦、氨甲基膦酸、乙酰氨甲基膦酸、草銨膦和3-(甲基膦基)丙酸5種化合物。將此方法應用到泰州市自來水和河水中此5種物質的檢測中，從而對泰州河水中草甘膦和草銨膦的富集污染情況有了初步了解。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Waters ACQUITY超高效液相色譜(美國,Waters公司)；AB SCIEX API4000+質譜儀(美國,AB公司)；中佳HC-3018R高速冷凍離心機。

草甘膦(純度99%)、氨甲基膦酸(純度99%)、草銨膦(純度99%)、3-(甲基膦基)丙酸(純度99%)、乙酰氨甲基膦酸(純度99%)，均購于Sigma公司(美國)。稱取以上各物質0.1 g于100 mL容量瓶中，用純水定容，得濃度為1 mg/mL的標準儲備溶液，于4 ℃下保存；混合標準使用液根據實驗需要用0.1%甲酸水溶液稀釋配制。乙腈(色譜純，德國Merck公司)；甲酸(色譜純，美國Tedia公司)；實驗用水為屈臣氏瓶裝蒸餾水。

1.2 水樣的采集與儲存方法

水樣采集與儲存同國家標準(GB/T 5750.9-2006)中的方法。泰州城區生活飲用水樣品共采集20份，分別為二次供水4份、管網末梢水14份，出廠水4份；泰州城區內河水共43份；泰州城區周邊農村河水13份。

1.3 樣品前處理

將采集的水樣充分混勻后，取1.0 mL于2.5 mL具塞塑料管中，加入1 μL甲酸，混勻，置于高速離心機中,以20 000 r/min離心10 min，取上清液直接測定。

1.4 超高效液相色譜-質譜條件

1.4.1 色譜條件色譜柱：SIELC Obelisc N柱(50 mm×2.1 mm，5 μm)；流動相：0.1%甲酸水溶液+乙腈=99+1，等度洗脫。流速：0.6 mL/min；進樣體積：20.0 μL；柱溫：40 ℃；樣品室溫度：25 ℃。保留時間定性，峰面積外標法定量。

1.4.2 質譜條件電噴霧電離源，負離子(ESI-)掃描；采集模式：多反應監測(MRM)模式；碰撞氣壓力(CAD)：4 Pa；氣簾氣壓力(CUR)：30 Pa；霧化氣壓力(GS1)：65 Pa；輔助氣壓力(GS2)：65 Pa；入口電壓(EP)：10 V；碰撞室出口電壓(CXP)：15 V；噴霧電壓：4 000 V；氣化溫度：350 ℃。定量和定性離子、碰撞能量等參數見表1。

表1 5種物質的保留時間、相對分子質量和優化的質譜分析參數

2 結果與討論

2.1 樣品前處理條件的選擇

草甘膦、氨甲基膦酸、乙酰氨甲基膦酸、草銨膦和3-(甲基膦基)丙酸5種化合物屬于水溶性強極性的弱酸性化合物，在酸性條件下相對穩定，因此在處理水樣時加入微量甲酸使樣品呈微酸性。

2.2 色譜柱的選擇

考察了Waters Atlantis T3色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)和SIELC Obelisc N色譜柱(50 mm×2.1 mm，5 μm)的分離效果。結果表明：5種化合物在Waters Atlantis T3色譜柱中出峰很快，并且拖尾嚴重。而SIELC Obelisc N色譜柱具有很好的極性特點，非常適用于極性以及帶電樣品的分離，在上述流動相條件下能將5種極性的待測物分離。故實驗選擇SIELC Obelisc N色譜柱(50 mm×2.1 mm，5 μm)。

圖1 5種標準混合物質的MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of the five mixed standard solution

2.3 流動相的選擇

比較了甲醇、甲醇∶0.1%甲酸水(50∶50)、甲醇∶0.1%甲酸水(30∶70)、甲醇∶0.1%甲酸水(1∶99)等幾種流動相，發現甲醇∶0.1%甲酸水(1∶99)能夠很好的分離5種待測物。在0.2～1.0 mL/min范圍內改變流動相流速，在0.6 mL/min時出峰時間合適，峰形較好。綜合考慮，確定測定的色譜條件為：流動相為甲醇∶0.1%甲酸水(1∶99)，流速0.6 mL/min，柱溫40 ℃，進樣量：20 μL。各個待測物的MRM色譜圖如圖1所示。

2.4 線性關系

5種待測物儲備溶液用0.1%甲酸水溶液稀釋配制成10 μg/mL的標準混合溶液，然后再稀釋成濃度為1、2、5、10、20、50、100、200、500 ng/mL標準工作溶液系列。以上述色譜-質譜條件，對系列標準工作液進行分析，采用多點線性校正，建立峰面積-待測物濃度標準曲線。以3倍噪音為樣品檢出限。本方法5種物質的回歸方程、線性相關系數和檢出限見表2。

表2 5種化合物的線性方程、相關系數、檢出限(LOD)

2.5 回收率、精密度和檢出限

在處理的水樣中添加標準混合溶液，制備20、50、150 ng/mL 3個濃度加標水平的樣品，每個濃度水平設6個平行樣品。用本方法進行測定，平均回收率和相對標準偏差見表3。

表3 回收率與相對標準偏差試驗結果(n=6)

2.6 方法的應用

用本方法分別對泰州市生活飲用水20份、城區河水共43份和周邊農村河水13份樣進行檢測。其中生活飲用水中5種化合物均為檢出；城區河水中草甘膦和氨甲基膦酸檢出率分別為74.4%和72.1%，濃度范圍分別為0.36～0.59 μg/L和0.15～7.23 μg/L，其余3種物質均未檢出；周邊農村河水中草甘膦和氨甲基膦酸檢出率分別為15.4%和76.9%，濃度范圍分別為0.43～0.50 μg/L和0.30～1.60 μg/L，其余3種物質均未檢出。部分樣品色譜見圖2和圖3。生活飲用水中草甘膦和其代謝物沒有檢出可能是飲用水中余氯對草甘膦的分解有較大影響[17]。

圖2 樣品中氨甲基膦酸的MRM色譜圖Fig.2 MRM chromatogram of AMPA in the sample

圖3 樣品中草甘膦的MRM色譜圖Fig.3 MRM chromatogram of Glyp in the sample

3 結論

本研究建立了超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定水樣中草甘膦、氨甲基膦酸、乙酰氨甲基膦酸、草銨膦和3-(甲基膦基)丙酸5種化合物。該方法簡便、快速、準確，適用于水中草甘膦、氨甲基膦酸、乙酰氨甲基膦酸、草銨膦和3-(甲基膦基)丙酸的殘留檢測。通過對泰州市生活飲用水和河水中5種有機膦農藥及其代謝物的檢測，大致了解了泰州市生活飲用水和河水中有機膦農藥及其代謝物的污染情況。城區河水中草甘膦代謝物檢出率比周邊農村河水高可能是城區河水的流動性差導致的。由于采集樣品數量有限，故結果不足以說明泰州河水中草甘膦污染的整體趨勢，不過從另一方面可以推斷，泰州河水正經受著一定程度上草甘膦的污染，這種情況與近年來對除草劑草甘膦的大量使用有著一定的關系。