缺氧誘導因子-1α上調Cx43表達造成星形膠質細胞損傷的作用機制研究

官俏兵 張曉玲 沈和平 俞曉翔 阮水良

近年來，星形膠質細胞在中樞神經系統中的作用得到了較多的研究[1]。在缺血缺氧性腦病的研究中發現星形膠質細胞可以通過自身炎癥反應釋放大量炎癥因子，造成神經細胞損傷[2-3]。缺血缺氧條件下，縫隙連接蛋白（Cx43）的表達增加，且空間分布發生改變，從而調控細胞通道蛋白表達，介導物質交換。Cx43還可以通過增加星形膠質細胞半通道的開放、減少全通道的活性來增加神經細胞的敏感性，促進細胞死亡的發生[4-5]。缺氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1 alpha，HIF-1α）可以促進凋亡蛋白B細胞淋巴瘤/白血病-2基因相關X蛋白（B-cell lymphoma-2 associated X，BAX）的表達，B細胞淋巴瘤/白血病-2基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）蛋白下調，而HIF-1α敲除后可以明顯抑制缺血缺氧性腦損傷[6-7]。也有研究表明，HIF-1α的高表達可以促進血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）的表達，激活血管內皮細胞生長因子受體2通路，促進腦血管的新生[8]。鑒于Cx43在缺血缺氧性腦病中的重要作用，本研究對糖氧剝奪（oxygen glucose deprivation，OGD）條件下，HIF-1α 上調Cx43表達造成星形膠質細胞損傷的作用機制進行了進一步探討。

1 材料和方法

1.1 主要材料 人星形膠質細胞HA細胞株（實驗室自備）；HEK293T細胞（武漢普諾賽生命科技有限公司，批號：CL0005）；大腸桿菌感受態細胞 DH5α（北京天根生化科技有限公司，批號：CB10101）；慢病毒載體GV218、陰性對照慢病毒（上海吉凱公司，批號：K857435）；RT-qPCR試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號：18573364）；質粒抽提試劑盒（美國Promega公司，批號：194754）；DMEM、Opti-MDM 培養基（美國 Invitrogen公司）；Lipofectamine 2000（美國 Invitrogen公司）；HIF-1α和Cx43的引物（上海生工生物工程公司合成）；HIF-1α 的小干擾 RNA（siRNA）及對照（蘇州吉瑪公司）；CCK-8試劑盒（碧云天生物技術有限公司，批號：C0038）；Annexin-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒（美國BD公司，批號：556547）；TUNEL染色試劑盒（美國Roche公司，批號：11767305001）；谷氨酸水平檢測試劑盒（美國 Biovision公司，批號：629100）；TNF-α、IL-6的ELISA檢測試劑盒（上海酶聯生物有限公司，批號：1077385、1058097）；Bcl-2、B 細胞淋巴瘤/白血病-2 基因相關啟動子（Bad）、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）、細胞色素 C（Cyt-C）、Cx43、HIF-1α 的單克隆抗體（美國Cell Signaling Technology 公司，批號：15071、189208、966208、11940、3512、36169）；蛋白提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號：1800125）。

1.2 過表達HIF-1α的HA細胞系的構建 將制備的質粒20 μg與Opti-MEM培養基混合，用Lipfeceamine 2000轉染至HEK293T細胞（用于質粒的擴增和提?。?。培養12 h后，棄去培養基，更換完全培養基繼續培養48 h，收集上清液后用0.45 μm的濾膜過濾，離心后得到擴增后的質粒濃縮液。HA細胞生長至對數期，將質粒濃縮液稀釋后與HA共培養，進行質粒的轉染，24 h后吸去培養基，更換完全培養基繼續培養。同時設置陰性對照組。將過表達HIF-1α的HA細胞定為HIF-1αlent組，而陰性組為NC-lent組，未經過處理的HA細胞為Con組。

1.3 siRNA沉默HA細胞中HIF-1α基因的表達 取對數期的細胞進行轉染，將細胞接種于6孔板內，待細胞長至80%左右進行轉染。設置對照組（Con，未經過處理的HA細胞）、siRNA陰性對照組（siRNA-NC）和siRNA-HIF-1α組。將siRNA-HIF-1α溶解于Opti-MEM培養基中，室溫孵育5 min，另外取Lipofectamin 2000溶解于Opti-MEM培養基中，室溫孵育5 min，混合2種Opti-MEM液，孵育5 min后加入HA細胞中，室溫孵育6 h后更換為正常的完全培養基進行培養。48 h后進行轉染效率的檢測。

1.4 HIF-1α、Cx43 mRNA表達水平檢測 采用RT-qPCR法。將細胞接種至6孔板中，分組后置于OGD條件下（將細胞置于缺氧罐中模擬OGD環境）培養24 h。培養完成后細胞刮刮下細胞并收集。Trizol試劑裂解細胞后提取總RNA，按逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄反應，設置GAPDH為內參，GAPDH上游引物:5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游引物：5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′；HIF-1α 上游引物 ：5′-CAAAACACACAGCGAAGC-3′，下游引物：5′-TCAACCCAGCATATCCACC-3′；Cx43 上游引物 ：5′-TCACTGGGGTGACTTCACTACTTT-3′，下游引物：5′-AGGCTGACTCAACCGCTGTC-3′。逆轉錄合成的反應條件為 70 ℃ 5 min，0 ℃ 5 min，37 ℃ 5 min，42 ℃ 60 min，70℃ 10 min，-20℃保存。PCR的反應體系為20 μl，其中 SYBR Premix Ex Taq 10 μl、cDNA 2 μl、上下游引物各 0.4 μl、CEPC 水 7.2 μl。PCR 擴增反應條件為:94 ℃5 min預變性，94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共 30個循環，72 ℃延伸 10 min。采用 2-ΔΔCt相對定量法，以GAPDH為內參，分析mRNA的相對表達水平。

1.5 HIF-1α、Cx43、細胞凋亡相關蛋白 Bad、Caspase-3、Cyt-C、Bcl-2蛋白表達水平檢測 采用Western blot法。將細胞接種至6孔板中，分組后置于OGD條件下培養24 h。培養完成后細胞刮刮下細胞并收集。PBS洗2次后，在冰上加入NP-40裂解液100 μl裂解30 min，同時不定時震蕩，保證裂解液的充分接觸。3 000 r/min離心15 min，收集上清液后BCA試劑盒進行蛋白濃度的定量并調整蛋白濃度，電泳，轉膜，PVDF膜使用5%脫脂奶粉封閉2 h，用TBST稀釋一抗（單克隆抗體），4℃一抗過夜孵育，次日取出PVDF膜后用TBST洗2次后，用辣根過氧化物酶標記的二抗在37℃孵育4 h。孵育完成后用化學發光法檢測，采用Image Pro-Plus 6.0軟件進行灰度值的分析，以GAPDH為內參，結果以目的蛋白光密度值與內參蛋白光密度值之比表示。

1.6 細胞活力檢測 采用CCK-8法。OGD條件下培養3、6、9、12、15、18、21、24 h 后，加入 10 μl的 CCK-8 試劑，在常規培養條件下繼續孵育4 h，同時設置空白對照。孵育完成后在480 nm處檢測吸光度（OD）值。細胞活力=[（OD實驗組-OD背景）/（OD對照組-OD背景）]×100%。

1.7 細胞凋亡率檢測 將細胞接種到6孔板中，OGD條件下培養24 h，收集細胞后加入Binding Buffer重懸。而后加入Annexin V-FITC液10 μl混勻避光反應10 min，再加入10 μl的PI染色避光反應10 min，PBS洗去多余染色液后，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.8 谷氨酸水平檢測 將細胞接種至6孔板中，分組后置于OGD條件下培養24 h。培養完成后細胞刮刮下細胞并收集。按照細胞個數1 000∶2的比例加入試劑（1 000個細胞加入2 μl），破碎細胞后常溫下離心，取上清液。采用分光光度法檢測570 nm處的OD值，然后根據標準曲線測定谷氨酸水平。谷氨酸水平以mg/L表示。

1.9 培養基中炎癥因子NO、TNF-α、IL-6表達水平檢測 采用ELISA法。將細胞接種至6孔板中，分組后置于OGD條件下培養24 h。取細胞培養基后離心，得到上清液，按照ELISA試劑盒說明書進行操作。

1.10 統計學處理 采用SPSS 17.0統計軟件。計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HIF-1α對于OGD條件下Cx43表達的影響 慢病毒過表達HIF-1α后，相比Con組和NC-lent組，HIF-1α-lent組HIF-1α及Cx43 mRNA和蛋白表達水平在OGD條件下均上調，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。而siRNA沉默HIF-1α后，相比Con組和siRNA-NC組，siRNA-HIF-1α組 HIF-1α 及 Cx43 mRNA和蛋白表達水平在OGD條件下均下調，差異均有統計學意義（均 P＜0.05），見圖 1。

2.2 HIF-1α對于OGD條件下HA細胞活力的影響慢病毒過表達HIF-1α后，不同時間點Con組和NC-lent組細胞活力比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）；而相比Con組和NC-lent組，HIF-1α-lent組細胞活力下降，差異均有統計學意義（均P＜0.05），siRNA沉默HIF-1α 后，OGD 條件下處理 3、6、9、12、15、18、21、24 h，不同時間點Con組和siRNA-NC組細胞活力比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）；而相比Con組和siRNA-NC組，siRNA-HIF-1α組細胞活力升高，差異均有統計學意義（均 P＜0.05），見圖 2。

2.3 HIF-1α對于OGD條件下HA細胞凋亡率的影響慢病毒過表達HIF-1α后，Con組、NC-lent組和HIF-1α-lent組細胞凋亡率分別為（32.35±3.15）%、（37.32±4.15）%和（63.54±5.12）%。相比 Con組和 NC-lent組，HIF-1α-lent組細胞凋亡率升高，差異均有統計學意義（均 P＜0.05）。siRNA 沉默 HIF-1α后，Con組、siRNANC組和siRNA-HIF-1α組細胞凋亡率分別為（42.35±5.14）%、（40.24±4.12）%和（18.65±2.13）%。相比 Con 組和siRNA-NC組，siRNA-HIF-1α組細胞凋亡率下降，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖3。

圖1 缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）對于糖氧剝奪（OGD）條件下縫隙連接蛋白（Cx43）表達的影響[（a：HIF-1α對于OGD條件下HIF-1α和Cx43蛋白表達水平的電泳圖；b：HIF-1α和Cx43 mRNA表達水平結果；c：HIF-1α和Cx43蛋白表達水平結果；d：沉默HIF-1α后，HIF-1α和Cx43 mRNA表達水平結果；e：沉默HIF-1α后，HIF-1α和Cx43蛋白表達水平結果；與Con組比較，*P＜0.05；與 NC-lent組和小干擾 RNA（siRNA）-NC 組比較，△P＜0.05]

圖2 缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）對于糖氧剝奪條件（OGD）條件下HA細胞活力的影響[a：HIF-1α過表達后，細胞活力改變的結果；b：沉默HIF-1α后，細胞活力改變的結果；與Con組比較，*P＜0.05；與小干擾RNA（siRNA）-NC組和NC-lent組比較，△P＜0.05]

圖3 缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）對于糖氧剝奪（OGD）條件下HA細胞凋亡率的影響（siRNA為小干擾RNA）

2.4 HIF-1α對于OGD條件下HA細胞谷氨酸水平的影響 慢病毒過表達HIF-1α后，Con組和NC-lent組細胞中谷氨酸水平比較差異無統計學意義（P＞0.05）；而相比Con組和NC-lent組，HIF-1α-lent組細胞中谷氨酸水平升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。siRNA沉默HIF-1α后，Con組和siRNA-NC組細胞中谷氨酸水平比較差異無統計學意義（P＞0.05）；而相比Con組和siRNA-NC組，siRNA-HIF-1α組細胞中谷氨酸水平下降，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖4。

圖4 缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）對于糖氧剝奪（OGD）條件下HA細胞谷氨酸水平的影響[與Con組比較，*P＜0.05；與NC-lent組和小干擾 RNA（siRNA）-NC 組比較，△P＜0.05]

2.5 HIF-1α對于OGD條件下HA細胞培養基中NO、TNF-α、IL-6表達的影響 慢病毒過表達HIF-1α后，Con組和 NC-lent組細胞中NO、TNF-α、IL-6表達水平比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）；而相比Con組和NC-lent組，HIF-1α-lent組細胞培養基中NO、TNF-α、IL-6表達水平均升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。siRNA沉默HIF-1α后，Con組和siRNA-NC組細胞培養基中NO、TNF-α、IL-6表達水平比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）；而相比Con組和siRNANC 組，siRNA-HIF-1α 組細胞培養基中 NO、TNF-α、IL-6表達水平均下降，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖5。

2.6 HIF-1α對于OGD條件下HA細胞凋亡相關蛋白表達的影響 慢病毒過表達HIF-1α后，Con組和NC-lent組細胞凋亡相關蛋白表達水平比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）；而相比Con組和NC-lent組，HIF-1αlent組中Bad、Caspase-3、Cyt-C蛋白表達水平均上調，而Bcl-2蛋白表達水平下調，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。siRNA沉默HIF-1α后，Con組和siRNA-NC組細胞凋亡相關蛋白表達水平比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）；而相比Con組和siRNA-NC組，siRNA-HIF-1α組中Bad、Caspase-3、Cyt-C蛋白表達水平均下調，而Bcl-2蛋白表達水平上調，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖 6。

3 討論

圖5 缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）對于糖氧剝奪（OGD）條件下培養基中炎癥因子NO、TNF-α、IL-6表達的影響[a：HIF-1α過表達后，NO、TNF-α、IL-6 的表達水平；b：沉默 HIF-1α 后，NO、TNF-α、IL-6 的表達水平；與 Con 組比較，*P＜0.05；與 NC-lent組和小干擾RNA（siRNA）-NC 組比較，△P＜0.05]

圖6 缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）對于糖氧剝奪（OGD）條件下HA細胞凋亡相關蛋白表達的影響 [a：HIF-1α對于OGD條件下HA細胞凋亡相關蛋白表達的電泳圖；b：HIF-1α過表達后，蛋白的相對表達水平；c：HIF-1α沉默后，蛋白的相對表達水平；Bad為B細胞淋巴瘤/白血病-2基因相關啟動子；Caspase-3為半脫氨酸蛋白酶-3；Cyt-C為細胞色素C；Bcl-2為B細胞淋巴瘤/白血病-2基因相關X蛋白；與Con組比較，*P＜0.05；與NC-lent組和小干擾RNA（siRNA）-NC 組比較，△P＜0.05]

HIF-1是一個在缺血缺氧狀態下調節氧穩態的轉錄因子，有異源二聚體α和β亞基組成，和促紅細胞生成素基因上的低氧反應原件結合[9]。其中HIF-1α是較為重要的轉錄因子，在缺氧條件下，細胞內的HIF-1α表達水平增高，轉移至細胞核內并且持續高表達，同時不受到氧濃度的影響[10]。在缺氧性腦病的研究中發現，腦損傷的發生和HIF-1α具有密切的關系，一方面，HIF-1α可以促進促紅細胞生成素及受體的表達，誘導腦紅蛋白和血管生長因子的表達，啟動應激反應[11]；另一方面可以調控細胞定向遷移、促進集體修復?？梢哉fHIF-1α具有雙刃劍的作用，且與多種基因和信號的改變有關。凋亡是腦缺血缺氧后細胞死亡的一種方式。有研究表明HIF-1α可以調控細胞的凋亡[12-13]。在血管內皮細胞的研究中已經發現，RNA干擾HIF-1α的表達后，在OGD條件下，細胞凋亡受到抑制[14]。而Williams等[15]研究發現HIF-1α調控凋亡的作用和凋亡基因Bad、Bax依賴性有關。HIF-1α還可以通過負反饋調節細胞的凋亡，凋亡抑制基因Survivin是凋亡蛋白抑制基因家族成員，當HIF-1α沉默后，缺氧條件下Survivin基因的表達受到HIF-1α的調控，且表達上調，同時抑制了缺血缺氧條件下神經細胞的凋亡[16]。

Cx43是縫隙連接蛋白的一種，是細胞通訊的主要方式之一。缺血性損傷后，半通道由關閉轉向開放狀態，介導物質的轉運[17]。研究發現，缺血缺氧后，Cx43的表達顯著增高，尤其是磷酸化水平增高，且腦損傷的程度和Cx43的細胞內轉位和表達水平增高呈正比[18]。Retamal等[19]研究發現，抗霉素A處理抑制Ast后，Cx43通道開放，同時細胞內染料的攝取量增高。Kalvelyte等[20]研究發現，Cx43過表達后，可以加速Hela細胞的凋亡程度。Cx43在星形膠質細胞中的表達水平最高，分布也最為廣泛。星形膠質細胞作為神經細胞的輔助性細胞，在缺血缺氧性腦損傷中具有廣泛的作用。當Cx43表達增高后，可以介導星形膠質細胞的損傷，同時釋放炎癥因子，擴大損傷。但是目前Cx43的表達調控機制尚不清楚。

鑒于HIF-1α作為轉錄因子的重要作用，本實驗采用了過表達和siRNA沉默方法研究HIF-1α對于Cx43的調控作用。結果顯示，在HIF-1α過表達后，OGD條件下，Cx43的表達也增高，兩者呈正相關。同時星形膠質細胞中炎癥因子的表達增高，細胞凋亡率增高。這提示，HIF-1α可以調控Cx43的表達，同時Cx43高表達后進一步促進了星形膠質細胞的損傷。而siRNA沉默HIF-1α后，Cx43的水平也下調，抑制了星形膠質細胞的損傷。因此，從過表達和基因沉默實驗結果來看，HIF-1α可以調控Cx43的表達，以此影響星形膠質細胞的狀態。

綜上所述，本實驗發現HIF-1α可以通過調控Cx43的表達來影響缺血缺氧下星形膠質細胞的損傷，這是HIF-1α在缺血缺氧性腦病損傷中的作用機制之一。