leptin和HIF-1α對慢性阻塞性肺疾病患者預后影響的研究

葉颯 王飛燕 周宏斌

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是呼吸系統的常見疾病，是全球第三大死亡原因疾病，造成了巨大的社會負擔及經濟負擔[1-2]。COPD以持續性呼吸道氣流受限和急性加重為特征，氣流受限通常是漸進性的，與呼吸道慢性炎癥反應有關[3]。關于COPD的病理機制尚未明確，目前認為炎癥機制、蛋白酶和抗蛋白酶失衡機制、氧化應激機制、自主神經功能失調和營養不良等參與COPD的發生、發展[4-6]，其中炎癥機制仍是當前臨床研究的焦點。COPD發病有多種細胞因子參與。瘦素（leptin）是一種多效性細胞因子，主要由脂肪細胞分泌，leptin信號在下丘腦神經內分泌中起著重要作用，它控制食欲和能量的平衡。COPD患者存在體重減輕、食欲不振等問題，可能與leptin有關[7]。缺氧誘導因子 1α（hypoxia-inducible factor 1 alpha，HIF-1α）是缺氧平衡的主要調節因子，COPD患者因缺氧可誘導HIF-1α持續表達，在HIF-1α及其下游的血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的作用下促進肺血管重塑[8-9]。leptin作為炎癥調節因子，對VEGF起著正向調節作用，同時在體外實驗中可誘導磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）、絲裂原活化蛋白激酶和蛋白激酶C信號通路激活HIF-1α，從而促進VEGF的表達，加速COPD的進程[10]。目前leptin和HIF-1α與COPD的關系尚不明確，本研究通過分析COPD患者血清leptin和HIF-1α水平與各項臨床指標及預后的關系，探討血清leptin和HIF-1α水平對COPD患者預后的影響。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2013年8月至2016年8月在浙江省人民醫院診治的穩定期COPD患者83例（COPD組），其中男 55 例，女 28 例；年齡 58～91（73.95±7.93）歲；BMI（20.86±3.01）kg/m2；吸煙 50例（60.24%），不吸煙 33例（39.76%）。所有入組患者均符合2019年COPD全球倡議（GOLD）指南中的COPD診斷標準[11]。納入標準：（1）經支氣管擴張劑治療后，行肺功能檢查，第一秒用力呼氣容積（forced expiratory volume in one second，FEV1）/用力肺活量（forced vital capacity，FVC）＜0.70，并根據FEV1%將患者分為GOLD 1～4級。1級：FEV1≥80%預計值，2級：50%≤FEV1＜80%預計值，3 級：30%≤FEV1＜50%預計值，4 級：FEV1＜30%預計值；（2）患者的咳嗽、咳痰和氣促等臨床表現較穩定，或只是表現出輕微的癥狀，病情基本恢復到急性加重前的狀態；（3）無咳膿性痰、發熱等，無WBC或中性粒細胞百分比增高，無肺炎的影像學證據；（4）定期門診或電話隨訪30個月以上獲取生存時間。排除標準：（1）COPD急性加重；（2）合并間質性肺病、哮喘、肺結核、肺炎、肺癌等器質性疾??；（3）合并糖尿病、嚴重心腦血管疾病、自身免疫性疾病、神經系統疾病或肝腎功能障礙；（4）合并精神疾病、認知功能障礙和溝通障礙；（5）合并其他腫瘤。另選取同期本院體檢中心的健康體檢者45例作為正常對照組，其中男29例，女 16 例；年齡 58～87（72.67±7.25）歲；BMI（22.78±3.58）kg/m2；吸煙 27例（60.00%），不吸煙18例（40.00%）。兩組受試者性別、年齡和吸煙率比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），但兩組受試者BMI比較差異有統計學意義（P＜0.05）。本研究經醫院醫學倫理委員會審查通過，所有患者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 血清leptin和HIF-1α水平檢測 確認符合納入標準和排除標準后，收集受試者外周靜脈血2 ml，加入抗凝試管中，1 500 r/min離心10 min，分離上清液后-80°C保存。采用ELISA法檢測所有受試者血清leptin和HIF-1α水平，嚴格按照試劑盒（leptin批號：p175117，HIF-1α批號：p210202，美國R&D生物技術有限公司）說明書操作。采用MD550酶標儀（美國Bio－Rad公司）檢測吸光度（A值）的變化，于酶標儀450 nm讀取結果，570 nm進行矯正。根據Breyer等[12]的方法，將血清leptin水平除以BMI以消除其影響。

1.2.2 COPD組病情嚴重程度的綜合性評估

1.2.2.1 GOLD分級 見1.1對象中納入標準（1）。

1.2.2.2 改良版英國醫學研究委員會（modified British Medical Research Council，mMRC）呼吸困難問卷評分采用mMRC呼吸困難問卷對COPD組患者進行評分。0級：劇烈活動時出現呼吸困難；1級：平地快步行走或爬緩坡時出現呼吸困難；2級：由于呼吸困難，平地行走時比同齡人慢或需要停下來休息；3級：在平地行走100 m左右或數分鐘后即需要停下來喘氣；4級：因嚴重呼吸困難而不能離開家，或在穿衣脫衣時即出現呼吸困難[13]。

1.2.2.3 急性加重風險評估 上一年發生2次或以上急性加重，提示今后急性加重風險增加。

1.2.2.4 COPD組病情嚴重程度的綜合性評估 根據GOLD分級、mMRC呼吸困難問卷評分及上一年急性加重次數進行綜合性評估分組：A組：GOLD分級1～2級，上一年急性加重次數≤1次，mMRC分級0～1級；B組：GOLD分級1～2級，上一年急性加重次數≤1次，mMRC分級≥2級；C組：GOLD分級3～4級，上一年急性加重次數≥2次，mMRC分級 0～1級；D 組：GOLD 分級 3～4級，上一年急性加重次數≥2次，mMRC分級≥2級。

1.3 統計學處理 采用SPSS 22.0統計軟件。計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；計數資料組間比較采用χ2檢驗。相關分析采用Pearson相關或Spearman秩相關。不同血清leptin/BMI、HIF-1α水平COPD患者生存時間的比較采用Kaplan-Meier生存曲線和log-rank檢驗；影響COPD組患者預后的多因素分析采用Cox比例風險回歸模型。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組受試者leptin/BMI和HIF-1α水平比較 COPD組患者leptin/BMI和HIF-1α水平均明顯高于正常對照組，差異均有統計學意義（均P＜0.01），見表1。

表1 兩組受試者leptin/BMI和HIF-1α水平比較

2.2 COPD組病情嚴重程度的綜合性評估分組 83例COPD患者中，mMRC呼吸困難問卷評分1分 7例，2分38例，3分29例，4分9例；GOLD分級：1級16例，2級30例，3級29例，4級8例；上一年急性加重次數≤1次為51例，≥2次為32例。根據2019年Gold指南，按GOLD分級、mMRC呼吸困難問卷評分及上一年急性加重次數進行綜合性評估分組，83例COPD組患者分為A組12例，B組37例，C組5例，D組29例。

2.3 COPD組不同臨床特征患者血清leptin/BMI和HIF-1α水平比較 COPD組患者中，年齡較大、GOLD分級高、mMRC呼吸困難問卷評分高、上一年急性加重次數≥2次、病情嚴重程度較重的患者leptin/BMI水平明顯較高（均 P＜0.05）；吸煙、GOLD分級高、mMRC呼吸困難問卷評分高、上一年急性加重次數≥2次、病情嚴重程度較重的患者HIF-1α水平明顯較高（均P＜0.05），見表 2。

表2 COPD組不同臨床特征患者血清leptin/BMI和HIF-1α水平比較

2.4 相關性分析 COPD組患者血清leptin/BMI水平和HIF-1α水平呈正相關（r=0.64，P＜0.01）。COPD組患者血清leptin/BMI、HIF-1α水平和FEV1%[COPD患者FEV1%為（57.75±19.94）%]均呈負相關（r=-0.59和-0.45，均P＜0.01），與mMRC呼吸困難問卷評分[COPD組患者mMRC呼吸困難問卷評分為（2.04±0.80）級]均呈正相關（r=0.40和0.22，均P＜0.05），與上一年急性加重次數[COPD組患者上一年急性加重次數為（1.66±1.00）次]呈正相關（r=0.75和0.53，均P＜0.01）。COPD組患者血清 leptin/BMI、HIF-1α水平與病情嚴重程度均呈正相關（r=0.48和 0.73，均 P＜0.01）。

2.5 不同血清leptin/BMI、HIF-1α水平COPD患者生存時間的比較 根據血清leptin/BMI水平的中位數（0.38 μg/L），將CODP組患者分為leptin/BMI水平＞0.38 μg/L 組 41例和 leptin/BMI水平≤0.38 μg/L 組 42例。其中leptin/BMI水平≤0.38 μg/L組生存時間為29.05（95% CI：28.12～29.98）個月，leptin/BMI水平＞0.38 μg/L 組生存時間為 25.39（95% CI：23.54～27.24）個月，兩組比較差異有統計學意義（χ2=11.43，P＜0.01），見圖1。根據血清HIF-1α水平的中位數（80.6 ng/L），將CODP組患者分為HIF-1α水平＞80.6 ng/L組42例和HIF-1α水平≤80.6 ng/L組41例。其中HIF-1α水平≤80.6 ng/L 組生存時間為 28.31（95% CI：27.24～29.38）個月，HIF-1α水平＞80.6 ng/L組生存時間為26.15（95% CI：24.26～28.04）個月，兩組比較差異無統計學意義（χ2=1.58，P＞0.05），見圖 2。

圖1 不同血清瘦素（leptin）/BMI水平慢性阻塞性肺疾?。–OPD）患者的生存曲線（a為 leptin/BMI≤0.38 μg/L；b 為 leptin/BMI＞0.38 μg/L）

圖2 不同血清缺氧誘導因子1α（HIF-1α）水平慢性阻塞性肺疾?。–OPD）患者的生存曲線（a為HIF-1α≤80.6ng/L；b為HIF-1α＞80.6 ng/L）

2.6 影響COPD組患者預后的多因素Cox比例風險回歸模型分析 Cox比例風險回歸模型顯示，血清leptin/BMI及FEV1%是影響COPD組患者預后的因素（均P＜0.05），見表 3。

表3 影響COPD組患者預后的多因素Cox比例風險回歸模型分析

3 討論

COPD是進行性氣流受限不可逆的慢性氣道炎癥性疾病，其主要表現為進行性的呼吸困難，細胞因子和炎癥介質在COPD的病理生理過程中起著重要作用。leptin與HIF-1α在許多慢性炎癥性疾病中發揮了作用，而它們與COPD預后的關系及機制目前尚不明確。筆者通過檢測穩定期COPD患者的血清leptin和HIF-1α水平，尋找它們和臨床指標的關系，試圖揭示它們在COPD病情發展及預后中的重要意義。

肺臟中存在著功能性leptin受體，肺部炎癥時leptin水平升高，提示leptin在呼吸系統疾病中起重要的調節作用。Breyer等[12]研究發現，COPD患者血清leptin水平和CRP均顯著升高，兩者之間有著相關性，由于BMI差異會影響血清leptin水平，BMI越高leptin水平越高，在矯正BMI差異后，發現leptin/BMI與CRP的相關性更加明顯。本研究發現與正常對照組相比，穩定期COPD患者BMI明顯降低，參照以上方法，本研究采用leptin/BMI代替leptin以矯正BMI的干擾。本研究發現COPD組患者血清leptin/BMI明顯高于正常對照組，且血清leptin/BMI與FEV1%呈負相關，與上一年急性加重次數呈正相關，提示leptin可能是COPD病情進展的生物學標志。

在人體內leptin的分泌主要受食物攝入的慢性刺激所控制，它被認為是一種與能量代謝環境適應有關的激素。體外研究表明leptin能通過PI3K/絲氨酸/蘇氨酸激酶（Akt）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）途徑激活HIF-1α加重氣道炎癥反應且這種作用在缺氧的狀態下更明顯[14]。隨著病情的進展，COPD患者低氧血癥逐漸惡化，骨骼肌的糖代謝異常導致leptin表達增加，而leptin水平增加，則導致患者食欲減退，攝入減少，BMI下降，呼吸肌力下降，最終導致肺功能下降。另有體外實驗表明leptin可通過NF-κB使VEGF和IL-6 RNA轉錄增加，從而促進肺血管重構，加重炎癥損傷[10]。另外，本研究發現COPD組患者血清HIF-1α水平明顯高于正常對照組，其水平與患者的FEV1%呈負相關，與上一年急性加重次數呈正相關，說明HIF-1α水平亦與COPD的病情發展密切相關。HIF-1α是一種炎癥調節因子，可被多種炎癥因子通過PI3K/Akt/mTOR途徑激活，而HIF-1α水平增高會導致TNF-α、IL-1b和IL-19等炎癥因子的表達，加重氣道的炎癥狀態。文獻報道在動物實驗中，NF-κB可通過激活HIF-1α促進COPD病情的發展[15]。本研究中吸煙患者血清HIF-1α水平較高，與Bewley等[16]研究一致，表明吸煙促進COPD的發展可能與吸煙導致HIF-1α水平增加，促進氣道炎癥有關。相關性分析顯示COPD組患者血清leptin/BMI水平和HIF-1α水平呈正相關，leptin/BMI和HIF-1α水平不僅與COPD患者FEV1%呈負相關，還與按病情嚴重程度（mMRC呼吸困難問卷評分、肺功能分級及上一年急性加重次數）的綜合性評估分組呈正相關，表明leptin/BMI和HIF-1α表達之間存在密切聯系，兩者不僅與COPD患者肺功能惡化相關，還與COPD患者的病情嚴重程度密切相關，其內在機制有待進一步研究。

通過生存分析及Cox比例風險回歸模型分析進一步揭示了leptin/BMI、HIF-1α和臨床指標對COPD患者預后的影響，結果表明患者leptin/BMI、FEV1%與COPD患者預后顯著相關，leptin/BMI低的患者預后較好，在隨訪期間死亡風險較低，而HIF-1α與預后的關系無統計學意義。leptin/BMI與COPD患者的營養狀態密切相關，研究表明營養狀態差的患者呼吸肌肌力下降，抗感染能力差，導致預后不良，而糾正營養狀態后患者的預后可得到顯著改善[17]。因此leptin/BMI或許可以作為判斷患者COPD預后的一個臨床指標。

綜上所述，本研究證明COPD患者血清leptin/BMI和HIF-1α水平明顯增高，且leptin/BMI和HIF-1α兩者水平呈正相關。COPD患者血清leptin/BMI、HIF-1α與FEV1%均呈負相關，還與按病情嚴重程度（mMRC呼吸困難問卷評分、肺功能分級及上一年急性加重次數）的綜合性評估分組呈正相關。因此，本研究推測血清leptin/BMI和HIF-1α可能與COPD病情發展密切相關，leptin/BMI水平高的COPD患者預后較差。