土槿皮乙酸通過調控PAX2 對宮頸癌細胞的影響

關德鳳，秦天生，楊永秀，3*

（1.蘭州大學第一臨床醫學院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省人民醫院婦科，甘肅 蘭州 730000；3.蘭州大學第一醫院婦科，甘肅省婦科腫瘤重點實驗室，甘肅 蘭州 730000）

宮頸癌（Cervical cancer，CC）是最常見的婦科惡性腫瘤，其發病率和死亡率在女性所有癌癥中位列第四［1］?？刂颇[瘤細胞的惡性增殖并誘發其凋亡是治療癌癥的重要途徑［2］。土槿皮乙酸是從土槿皮中分離提取的具有生物活性的二萜類化合物，具有廣泛的抗癌作用［3］，可誘發caspases 的激活，引起腫瘤細胞凋亡并有效減弱腫瘤細胞對于化療的耐藥性［4］，但其對宮頸癌的治療作用及其分子機制尚不明確。PAX2 是PAX 轉錄因子家族成員之一，在成年個體除在特定組織中表達外幾乎被完全沉默，近年來研究顯示，PAX2 在多種腫瘤組織中被重新激活并表現出促進癌細胞增殖、遷移的特性［5-6］。Wnt/β-catenin 信號通路在惡性腫瘤中起關鍵作用［7］，當Wnt 配體和Wnt 通路調節分子突變時導致Wnt 信號異常激活，進而促進CC 細胞的生長和侵襲，研究表明在不同CC 細胞系和活檢組織中，Wnt4、Wnt8A、Wnt10B 和Wnt14 相對高表達而Wnt7A 則被強烈下調［8-9］；而抑制Wnt 信號能夠不同程度的抑制CC 細胞增殖并促進其凋亡［10］。因此本研究分析了土槿皮乙酸對CC 細胞凋亡、遷移的影響，探究了土槿皮乙酸對PAX2 和Wnt/βcatenin 信號通路的作用，初步闡明土槿皮乙酸通過調控PAX2 對CC 細胞產生影響。

1 材料

1.1 細胞 人CC 細胞Hela、SiHa、CaSki、C33A和MS751 細胞系購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫（上海）。

1.2 藥物與試劑 土槿皮乙酸（美國Sigma 公司，貨號L8170）；MTT（北京索萊寶科技有限公司，貨號IM0280）；細胞凋亡檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公 司，貨 號CA1040）；Transwell 小 室（美 國Chemicon 公司，貨號ECM550）；LipofectamineTM2000 Transfection Reagent（美國Thermo Fisher 公司，貨號11668027）；Matrigel（北京索萊寶科技有限公司，貨號356231）；RIPA 裂解液（上海碧云天生物技術有限公司，貨號P0013C）；兔抗BAX 單克隆抗體（英國Abcam 公司，貨號ab32503）；兔抗Bcl-2 單克隆抗體（英國Abcam 公司，貨號ab185002）；兔抗MMP2 單克隆抗體（英國Abcam 公司，貨號ab215986）；兔抗MMP9 多克隆抗體（英國Abcam 公司，貨 號ab38898）；兔抗Cyclin D1 單克隆抗體（英國Abcam公司，貨號ab134175）；兔抗Survivin 單克隆抗體（英國Abcam 公司，貨號ab76424）；兔抗PAX2 單克隆抗體（英國Abcam 公司，貨號ab79389）；兔抗βcatenin 單克隆抗體（英國Abcam 公司，貨號ab32572）；兔抗p-β-catenin 多克隆抗體（英國Abcam公司，貨號ab27798）；兔抗GAPDH 單克隆抗體（美國CST 公司，貨號5174）；山羊抗兔IgG H＆L 抗體（英國Abcam 公司，貨號ab97051）；Alexa Fluor ?647 標記的山羊抗兔二抗（英國Abcam 公司，貨號ab150083）。

2 方法

2.1 細胞培養 C33A、Hela 和SiHa 細胞采用DMEM 培養基培養，MS751 和CaSki 細胞采用RPMI 1640 培養基培養。培養基中均加入10%FBS、1%青霉素和鏈霉素。所有細胞在5% CO2、37 ℃下無菌培養。

2.2 MTT 實驗 待細胞生長至80%匯合度時，胰蛋白酶消化配制成濃度為1.5×105/mL 的單細胞懸液，以每孔100 μL 接種于96 孔板中，過夜培養后加入不同濃度的土槿皮乙酸（2.5、5、10、20、40 μmol/L）或者0.16% DMSO 分別處理細胞24、48、72 h。處理結束后向培養板中加入新鮮的MTT（5 mg/mL），培養4 h，加入DMSO 進行溶解，在570 nm 波長下檢測吸光度值（OD），并計算抑制率和 IC50，抑制率＝［（OD空白組-OD給藥組）/OD空白組］×100%。

2.3 shRNA 干擾技術構建PAX2 低表達Hela 細胞株 將PAX2 shRNA 和NC shRNA 序列與Age I 酶切位點一起加入，并在酶消化后與pGC-FU 載體連接。然后將重組質粒轉染到HEK293T 細胞中，篩選出陽性細胞，提取質粒。將Hela 細胞接種到6孔板上，根據lipofectamine 2000 的說明，在細胞密度達到70%～80%后轉染細胞。使用250 μL 無血清培養基Opti-MEM 分別稀釋100 pmol PAX2 shRNA 和100 pmol NC shRNA 序列質粒，在室溫下孵育5 min，使用250 μL 無血清培養基Opti-MEM稀釋5 μL lipofectamine 2000，在室溫下孵育5 min，將稀釋后的PAX2 shRNA、NC shRNA 序列質粒分別與稀釋后的lipofectamine 2000 充分混合后，室溫溫育20 min，然后加入預先接種好細胞的培養孔中。細胞在5% CO2、37 ℃下培養8 h 使質粒轉入細胞，然后將細胞在完全培養基中培養24～48 h，用于后續的實驗。

2.4 細胞分組與處理 選擇對數生長期的細胞分為空白組、陰性對照組（用NC shRNA 質粒轉染），sh-PAX2 組（用PAX2 shRNA 質粒轉染），土槿皮乙酸組（用15 μmol/L 土槿皮乙酸處理未轉染的Hela細胞），土槿皮乙酸+sh-PAX2 組（用15 μmol/L土槿皮乙酸處理并用PAX2 shRNA 質粒轉染）

2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡 細胞接種于6 孔板，過夜培養，按照“2.4”項下加入藥物處理24 h后，胰酶消化成單細胞懸液，用PBS 洗滌細胞，然后收集1×105～5×105個細胞，每管中加入500 μL 結合緩沖液以懸浮細胞，然后加入5 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI，充分混合后，室溫下避光靜置孵育10 min。在1 h 內，將細胞轉移至流式細胞儀進行檢測。通過軟件分析構建包括四個象限的細胞直方圖。

2.6 Transwell 小室遷移實驗 將4 ℃預冷的以1∶5稀釋的基質膠加入到Transwell 上室中，鋪勻后在37 ℃下干燥70 min。制備各組細胞懸浮液，每組設置5 個重復孔，將細胞濃度調節至5×105/mL。向上室添加200 μL 細胞懸浮液，向下室添加500 μL 含有20% FBS 的培養基作為趨化因子。按照“2.4”項下加入藥物后將小室放入5%CO2、37 ℃下培養24 h，棉簽擦去上室中未轉移的細胞，PBS 漂洗，甲醇固定細胞，用0.1%結晶紫染色后，每孔選取5 個視野在光學顯微鏡下拍照，統計各組遷移細胞數目。

2.7 String 預測PAX2 潛在作用蛋白 在https：//string-db.org/網站上對PAX2 的作用蛋白進行預測。

2.8 免疫熒光實驗 將生長至對數期的各組細胞以4.5×104個接種至6 孔板中，過夜后按照“2.4”項下加入藥物處理細胞24 h，洗滌細胞，4%多聚甲醛固定細胞，0.25% Triton×100 透膜，10%山羊血清封閉，加入一抗4 ℃過夜，洗滌，加入二抗，室溫2 h，洗滌，倒置熒光顯微鏡拍照。

2.9 Western blot 實驗 待細胞生長至對數期，按照“2.4”項下加入藥物處理細胞24 h 后，采用RIPA 裂解液提取細胞總蛋白，加入上樣緩沖液。同時取一小部分用BCA 法檢測蛋白濃度。通過10%或12%的SDS-PAGE 電泳分離蛋白質并轉移到硝酸纖維素膜上。將膜用含有5% 脫脂牛奶的TBST 室溫封閉2 h。（PAX2、MMP2、MMP9、Bcl-2、BAX、GAPDH 以1∶1 000稀釋，Cyclin D1、Survivin 以1∶1 500稀釋，β-catenin 以1∶5 000 稀釋，p-β-catenin 以1∶800 稀釋）4 ℃下孵育一抗過夜，TBST 洗滌后室溫孵育二抗2 h，洗滌，加入ECL 發光液顯色并在自動曝光儀中拍照。采用ImageProPlus 軟件分析各蛋白條帶的灰度值，計算相對表達量。

2.10 統計學分析 采用SPSS 25.0 進行統計分析，計量資料以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，相關性分析采用Pearson 相關分析，以P≤0.05 表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 土槿皮乙酸對CC 細胞增殖的影響 在同一時間下土槿皮乙酸對各細胞增殖的抑制率均隨濃度的增加而增加，在同一濃度下土槿皮乙酸對各細胞增殖的抑制率均隨時間的增加而增加，提示土槿皮乙酸可時間-濃度依賴地抑制CC 細胞增殖（圖1）。此外在同一處理時間下，土槿皮乙酸對各細胞的IC50不同，其中在24、48、72 h 下的IC50由大到小依次均為MS751、C33A、CaSki、SiHa 和 Hela（表1）。由于Hela 細胞對土槿皮乙酸最敏感，故本研究選取Hela 細胞作為后續研究對象，土槿皮乙酸處理Hela 細胞24 h，IC50約為15 μmol/L，因此后續土槿皮乙酸處理濃度選為15 μmol/L。

3.2 各CC 細胞中PAX2 蛋白表達及其與土槿皮乙酸對各細胞的IC50的相關性分析 在各CC 細胞中，PAX2 蛋白表達由高到低依次為Hela、SiHa、CaSki、C33A 和MS751。經相關性分析發現，在各CC 細胞中PAX2 表達與土槿皮乙酸對各細胞24、48、72 h 的IC50均呈負相關，其中48、72 h 的IC50與PAX2 表達呈顯著性負相關（P＜0.05）（圖2）。

3.3 shRNA 轉染Hela 細胞后各組細胞中PAX2 蛋白表達 土槿皮乙酸可抑制Hela 細胞中PAX2 蛋白表達，與空白組相比，陰性對照組細胞中PAX2 蛋白表達無差異（P＞0.05）；與陰性對照組相比，sh-PAX2 組、土槿皮乙酸組和土槿皮乙酸+sh-PAX2組細胞中PAX2 蛋白表達均降低（P＜0.05）（圖3）。

圖1 土槿皮乙酸對CC 細胞增殖的影響（n=3）Fig.1 Effects of PAB on CC cells proliferation（n=3）

表1 土槿皮乙酸對各CC 細胞的IC50（μmol/L，，n=3）Tab.1 IC50 of PAB on all CC cells（μmol/L，，n=3）

表1 土槿皮乙酸對各CC 細胞的IC50（μmol/L，，n=3）Tab.1 IC50 of PAB on all CC cells（μmol/L，，n=3）

3.4 土槿皮乙酸和低表達PAX2 對Hela 細胞凋亡的影響 與空白組比較，陰性對照組細胞的早晚期凋亡率無變化（P＞0.05），sh-PAX2 組、土槿皮乙酸組和土槿皮乙酸+sh-PAX2 組細胞的早晚期凋亡率較陰性對照組均升高（P＜0.05）（圖4）。

3.5 土槿皮乙酸和低表達PAX2 對Hela 細胞遷移的影響 與空白組比較，陰性對照組細胞的遷移數無變化（P＞0.05），sh-PAX2 組、土槿皮乙酸組和土槿皮乙酸+sh-PAX2 組細胞的遷移數較陰性對照組比較，均降低（P＜0.05）（圖5）。

圖2 各CC 細胞中PAX2 蛋白表達及其與土槿皮乙酸對各細胞的IC50的相關性分析Fig.2 PAX2 protein expression in all CC cells and its correlation with IC50 of PAB on all CC cells

3.6 土槿皮乙酸和低表達PAX2 對Hela 細胞凋亡及轉移相關蛋白表達的影響 與空白組比較，陰性對照組細胞中Bcl-2、BAX、Cyclin D1、Survivin、MMP2 和MMP9 蛋白表達無變化（P＞0.05）；與陰性對照組相比，sh-PAX2 組、土槿皮乙酸組和土槿皮乙酸+sh-PAX2 組細胞中Bcl-2、Cyclin D1、Survivin、MMP2 和MMP9 蛋白表達均顯著降低，BAX蛋白表達均升高（P＜0.05）（圖6）。

圖3 各組細胞中PAX2 蛋白表達Fig.3 PAX2 protein expression in cells of each group

圖4 土槿皮乙酸和低表達PAX2 對Hela 細胞凋亡的影響Fig.4 Effects of PAB and weak PAX2 expression on Hela cells apoptosis

圖5 土槿皮乙酸和低表達PAX2 對Hela 細胞遷移的影響Fig.5 Effects of PAB and weak PAX2 expression on Hela cells migration

圖6 土槿皮乙酸和低表達PAX2 對Hela 細胞凋亡及轉移相關蛋白表達的影響Fig.6 Effects of PAB and weak PAX2 expression on the expression of proteins relevant to the apoptosis and metastasis of Hela cells

3.7 String 預測PAX2 潛在作用蛋白 借助蛋白質網絡的相互作用分析，發現癌癥信號傳導過程中PAX2 與Wnt 信號關系密切（圖7）。

圖7 String 預測PAX2 潛在作用蛋白Fig.7 Potential protein of PAX2 predicted by String

3.8 土槿皮乙酸和低表達PAX2 對Hela 細胞β-catenin、p-β-catenin 蛋白的影響 與空白組相比，陰性對照組細胞中β-catenin、p-β-catenin 蛋白表達無變化（P＞0.05），可見大量β-catenin 蛋白定位于細胞核；與陰性對照組相比，sh-PAX2 組、土槿皮乙酸組和土槿皮乙酸+sh-PAX2 組細胞中β-catenin、p-β-catenin 蛋白表達均降低（P＜0.05），可見定位于細胞核的 β-catenin 蛋白明顯減少（圖8）。

4 討論

圖8 土槿皮乙酸和低表達PAX2 對Hela 細胞β-catenin、p-β-catenin 蛋白的影響Fig.8 Effects of PAB and weak PAX2 expression on β-catenin and p-β-catenin proteins in Hela cells

土槿皮乙酸越來越多的被認為是一種潛在的抗癌活性物質，具有促進不同類型腫瘤細胞凋亡的作用，包括胃癌、肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、甲狀腺癌、胰腺癌和CC 等［11-12］。本研究發現土槿皮乙酸可時間-濃度依賴地抑制多種CC 細胞增殖，其中土槿皮乙酸對Hela 細胞24、48、72 h 的IC50均最小，提示Hela 細胞對土槿皮乙酸的干預最為敏感。前期研究發現土槿皮乙酸通過抑制PAX2 表達來誘導Hela 細胞凋亡并抑制其轉移，但是相關分子機制的文獻報道較少，有研究者在其他腫瘤細胞中對土槿皮乙酸抗腫瘤作用的分子機制做了大量的研究，發現土槿皮乙酸誘導腫瘤細胞凋亡并抑制其轉移所涉及的信號通路和靶分子多種多樣，包括PI3K/Akt、ERK1/2 信號或者 Bcl-2、PKC 和caspase 家族的多種分子［4，11］。本研究首先對各CC細胞中PAX2 蛋白表達進行檢測，并結合前面測出的土槿皮乙酸對各細胞的IC50，分析兩者之間的相關性，發現在各CC 細胞中，PAX2 蛋白表達由高到低依次為Hela、SiHa、CaSki、C33A 和MS751，并且與土槿皮乙酸對各細胞24、48、72 h 的IC50均呈負相關，提示土槿皮乙酸對各細胞增殖抑制能力與PAX2 表達呈正相關，PAX2 表達越高，細胞對土槿皮乙酸的增殖抑制的敏感性越高，土槿皮乙酸可能直接或間接靶向作用于PAX2，從而實現對Hela 細胞增殖和轉移的抑制，并誘導其凋亡。

PAX2 在起源于苗勒氏管的輸卵管、子宮內膜、宮頸和上部陰道的上皮細胞中表達［13］。PAX2在子宮內膜癌細胞中高表達，下調PAX2 可抑制細胞增殖、遷移和侵襲［14］。由于卵巢癌不同的組織學類型，PAX2 在卵巢癌中可能具有致癌和抑癌功能，這可能取決于卵巢癌細胞的表觀遺傳學改變［15］。PAX2 在CC 細胞中表達也大幅上調，用CP-31398 或sh-PAX2 處理Hela 和SiHa 細胞，可以抑制細胞增殖、侵襲和遷移，誘導細胞凋亡［16］。PAX2 越來越多的被認為是生殖器官相關癌癥發生的標志基因。本研究發現通過敲低Hela 細胞中PAX2 表達可顯著誘導Hela 細胞凋亡，上調促凋亡因子BAX 表達和下調抑凋亡因子Bcl-2、Survivin和Cyclin D1 表達；同時抑制Hela 細胞遷移以及下調MMP2 和MMP9 表達，MMP2 和MMP9 均通過降解細胞外基質促進腫瘤轉移；提示降低CC 細胞中PAX2 表達可誘導CC 細胞凋亡，抑制其轉移。進一步研究發現土槿皮乙酸可顯著抑制CC 細胞中PAX2 表達，同時誘導細胞凋亡并抑制其轉移。以上揭示土槿皮乙酸導致的PAX2 下調在土槿皮乙酸誘導的CC 細胞凋亡和抑制其轉移過程中扮演重要角色，但是其中的具體機制仍需進一步研究。

借助蛋白質網絡的相互作用分析，發現癌癥信號傳導過程中PAX2 與Wnt 信號關系密切。經典的Wnt/β-catenin 信號通路被發現與CC 細胞的增殖、轉移等相關［17］。在該通路中β-catenin 的異常磷酸化使其在細胞內積累并進入細胞核與TCF/LEF 形成轉錄復合物，調節多種下游周期和增殖相關因子的表達，包括cMYC、Cyclin D1、Survivin、Axin2和MMPs［18］。本研究發現土槿皮乙酸和低表達PAX2 均可降低Hela 細胞中β-catenin 和p-β-catenin蛋白表達，另外通過免疫熒光實驗對Hela 細胞中β-catenin 進行定位，發現土槿皮乙酸和低表達PAX2 組Hela 細胞核中β-catenin 表達顯著降低；結合前面土槿皮乙酸對CC 細胞PAX2 表達的抑制作用，提示土槿皮乙酸可通過影響PAX2 與Wnt/β-catenin 信號通路的相互作用，誘導CC 細胞凋亡并抑制其轉移。

綜上所述，在CC 細胞中，土槿皮乙酸通過抑制PAX2 表達和Wnt/β-catenin 信號通路來誘導細胞凋亡，抑制其轉移。提示土槿皮乙酸是誘導宮頸癌Hela 細胞凋亡的潛在治療藥物。