水蛭滑石粉燙制工藝的優化及其質量分析

劉 敬，趙 斌*，劉曉鑫，曹 暉，王 瓊

（1.中山火炬職業技術學院健康產業學院，廣東 中山 528436；2.國家中藥現代化工程技術研究中心中山健康產品分中心，廣東 中山 528436；3.廣東藥科大學中藥學院，廣東 廣州 510006；4.國家中藥現代化工程技術研究中心，廣東 珠海 519085）

水蛭是一味具有破血通經、逐瘀消癓的常用動物類中藥，現收載于2015 年版《中國藥典》一部［1］，該藥材使用歷史悠久，始載于《神農本草經》，但因其藥效峻猛、有小毒而被列為下品，臨床上常將其炮制后再內服使用［2］。漢代《金匱玉函經》載有“熬”，為水蛭最早的炮制方法，宋代至清末的文獻中還有不加輔料炮制（炒、煨、焙）、加輔料炮制（米制、石灰制、豬脂制、麝香制、鹽制、油制）等10 余種方法，實質上均為加熱處理［2-3］。

目前，市場上常見的水蛭炮制品有（凈）水蛭、燙水蛭、酒炙水蛭等，其中燙水蛭主要以滑石粉為輔料，收載于自1977 年版起的歷版《中國藥典》、1988 年版《全國中藥炮制規范》，以及廣西、浙江等地方炮制規范中［4-6］?，F代學者研究酒炙［7］、滑石粉加酒和姜炮制［8］、麥麩加酒炮制［9］、焙制、電熱烘烤［10］等水蛭炮制新方法，也關注了炮制前后其水溶性蛋白的差異性［11］、不同炮制方法下的體外抗凝活性［12］。但國家和地方炮制規范對水蛭燙制工藝的溫度、時間、滑石粉用量、翻炒速度等關鍵參數均無統一規定，大多憑藥工主觀經驗來進行評價［4-6］，從而影響了炮制品質量。課題組前期制定了一些藥材的滑石粉燙制工藝規范［13-15］，本實驗在此基礎上采用星點設計-效應面法優化水蛭滑石粉燙制工藝，并分析了炮制前后其理化指標的變化，以期為相關標準的制定提供參考。

1 材料

1.1 儀器 CY-20 型電熱型炒藥機（江陰市祝塘明科機械廠）；2500C 型粉碎機（永康市艾澤拉電器有限公司）；101-2AB 型鼓風烘箱（天津泰斯特儀器有限公司）；ATX224 電子分析天平（日本島津公司）；A300 全自動氨基酸分析儀（德國曼默博爾公司）；K9860 全自動凱氏定氮儀（濟南海能儀器股份有限公司）；DCY-12G 氮吹儀（青島?？苾x器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 水蛭購于廣州漢草醫藥科技有限公司（批號20170409），經中山火炬職業技術學院趙斌教授鑒定為水蛭科動物螞蟥Whitmania pigraWhitman?；郏兾魇ト疳t藥科技有限公司，批號20170518）；牛纖維蛋白原（100 mg，批號F20170412）、凝血酶（1 000 U，CAS 號9002-04-4）（合肥博美生物科技有限責任公司）；氨基酸標準品溶液（德國曼默博爾公司，含18 種氨基酸，胱氨酸濃度為50 nmol/mL，其余均為100 nmol/mL）。乙醇、氯化鈉、三羥甲基氨基甲、鹽酸等試劑均為分析純；水為去離子水。

2 方法與結果

2.1 燙制工藝優化

2.1.1 因素水平確定 翻炒速度為非連續性數據，故本實驗將其設定為12 r/min。以燙制溫度（A）、燙制時間（B）、滑石粉用量（C）為影響因素，各因素5 個水平，見表1。

2.1.2 燙制品制備 取20 份凈水蛭段，每份50 g。先將滑石粉加入炒藥機內，待機器達到規定溫度后再投入藥材，翻炒規定時間（12 r/min）后立即取出，篩去滑石粉，放涼，即得。

表1 因素水平

2.1.3 評價指標測定

2.1.3.1 粉碎率 取燙制品20 g，粉碎30 s 后過100 目篩，收集，稱定過100 目篩粉末的質量，計算粉碎率。

2.1.3.2 醇溶性浸出物 按2015 年版《中國藥典》四部2201 的醇溶性浸出物測定法中的熱浸法進行測定，浸出溶劑為稀乙醇。

2.1.3.3 抗凝血酶活性 按2015 年版《中國藥典》一部水蛭項下方法［1，16］進行測定。

2.1.4 數據處理 “2.1.3”項下指標測定結果越大，炮制效果越好，故本實驗按公式dmax＝（Yi-Ymin）/（Ymax-Ymin）進行轉換，求得“歸一值”［17］，再計算幾何平均數，得總評“歸一值”（OD），公式為OD＝（d1d2…dn）1/n（n＝3）。結果見表2。

表2 試驗設計與結果

2.1.5 模型擬合及方差分析 通過Design-Expert 8.0.5b版軟件對表2 數據進行多元線性回歸和二項式擬合，得方程為OD＝-0.57+0.036A+0.027B-0.031C-0.15AB-0.091AC-0.094BC-0.090A2-0.11B2-0.011C2（R2＝0.955 7，P＜0.000 1）。方差分析顯示，各因素影響程度依次為燙制溫度（A）＞滑石粉用量（C）＞燙制時間（B），其中炮制溫度具有顯著影響（P＜0.05）；所得方程擬合度良好，可信度高（R2＝0.955 7，P＜0.000 1）。

2.1.6 響應面分析 見圖1。綜合考慮實際炮制過程中的可操作性，確定最優工藝為燙制溫度195 ℃，燙制時間3.5 min，滑石粉用量30%，OD為0.641。

2.1.7 驗證試驗 根據優化工藝進行3 批驗證試驗，測得平均OD為 0.633，與預測值 0.641 接近（偏差為-1.25%），表明工藝穩定可行。生品和燙制品見圖2。

2.2 質量評價

2.2.1 水分、醇溶性浸出物、含氮量、抗凝血酶活性測定 按照2015 年版《中國藥典》方法進行測定［1］，結果見表3。由此可知，燙制后上述指標均較生品下降。

表3 水分、醇浸出物、含氮量、抗凝血酶活性測定結果（n=2）

2.2.2 氨基酸含有量測定 參考文獻［18］報道。精密稱取水蛭粉末約30 mg，置于水解管中，加入6 mol/L 鹽酸15 mL、苯酚3～4 滴，于冷凍機中冷卻3 min 后抽真空，充氮氣，重復3 次，在充氮氣狀態下封口，再于烘箱中加熱至110 ℃水解22 h，取出，冷卻至室溫，過濾水解液，濾液轉移至50 mL 量瓶中，水解管用水洗滌3～5 次，洗液合并至量瓶中，加水定容至刻度，精密吸取1.0 mL 至試管中，40 ℃下減壓干燥，殘渣加2 mL 水溶解后干燥，最后蒸干，精密加入pH 2.2 的檸檬酸鈉緩沖液1 mL，振搖溶解，濾過，取續濾液，作為供試品溶液。

圖1 各因素響應面圖

圖2 水蛭燙制前后形態

將對照品、供試品溶液注入氨基酸分析儀中，外標法計算含有量，結果見表4。由此可知，燙制品中氨基酸平均總量為51.71%，含全部16 種氨基酸，以谷氨酸含有量最高，達8.61 mg/100 mg，占氨基酸總量的16.7%；含有蘇氨酸等7 種人體必需氨基酸，總量為18.4 mg/100 mg，占氨基酸總量的35.6%。

表4 各氨基酸含有量測定結果（n=2）

3 討論

本實驗采用星點設計-效應面法，選擇燙制溫度、燙制時間、滑石粉用量3 個關鍵參數，對水蛭滑石粉燙制工藝進行優化，可為其炮制規范的制定提供合理依據?？傇u“歸一值”是多指標數據處理的一種較科學的方法，能客觀量化地體現所有指標，從而使模型具有更好的預測性［17］，本實驗將燙制工藝中的粉碎率、醇溶性浸出物、抗凝血酶活性等指標綜合起來，以該方法來表達最終效應，所得結果更科學合理。

生水蛭質韌難碎，氣味腥臭，嚴重影響其直接使用，故自古就對其進行加熱處理，其中滑石粉燙是最主流的炮制方法，其目的主要有去腥矯味、使藥材質地酥脆、利于粉碎、降低毒性等［2］。本實驗結果顯示，滑石粉燙制后水蛭含水量下降，質地松泡，腥臭味明顯下降，有利于臨床應用。