金寧方對環磷酰胺誘導免疫抑制小鼠的保護作用

俞杞泉，張惠勇，楊 揚，壽偉臻，張 琨，李 陽

（1.上海中醫藥大學附屬龍華醫院，上海 200032；2.上海中醫藥大學科技實驗中心，上海 201203）

肺癌是目前世界上最常見惡性腫瘤，嚴重危害人類的健康。肺癌患者存在不同程度的免疫抑制情況［1-2］，人體免疫應答與腫瘤的發生發展及治療存在著息息相關的聯系［3］。手術聯合放化療是目前治療肺癌的主要方式，環磷酰胺等臨床常用的化療藥物對機體免疫功能的抑制已得到明確證實［4］。

據文獻報道，中藥及其復方抗肺癌的機理與改善肺癌患者機體免疫功能有密切關系［5］。本課題組前期研究發現，采用中藥金寧方灌胃后提取的小鼠血清有明顯的抑瘤作用［6］。為了進一步觀察金寧方在免疫系統中的調控效應，本研究重點觀察了金寧方對環磷酰胺誘導的免疫抑制小鼠的影響，初步探討了該復方改善肺癌免疫功能低下狀態并達到抗癌作用的可能機制。

1 材料

1.1 試劑 環磷酰胺（安道生，批號8D229 A，規格0.2 g/瓶）購自龍華醫院西藥房；RPMI-1640 培養液購買自美國ThermoFisher 公司；紅細胞裂解液（Cat349202）購自美國BD 公司；刀豆球蛋白A（Concanavalin A，ConA，CatC5275）、脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS，Cat.L2630）均購自美國Sigma 公司；CCK-8 檢測試劑（CK04）購自日本同仁化學科技有限公司。

1.2 動物 Balb/c 小鼠35 只，雌性，體質量18～20 g（6 周齡），SPF 級，購自西普爾-必凱實驗動物有限公司（生產許可證號SCXK（滬）2013-0016）。飼養于上海中醫藥大學實驗動物中心SPF 屏障環境中，正常供食供水。所有實驗操作均符合實驗動物福利相關規定。

1.3 藥物 金寧方（石上柏30 g、石見穿30 g、干蟾皮15 g、僵蠶15 g、生牡蠣30 g）購自江蘇江陰天江藥業有限公司，制成顆粒劑（批號1907344）。

1.4 儀器 血細胞分析儀（邁瑞醫療國際股份有限公司，BC-2800 Vet）；全波長酶標儀［美谷分子儀器（上海）有限公司，Gemini XPS］。

2 方法

2.1 環磷酰胺誘導小鼠免疫抑制模型 將小鼠按隨機分為正常組、模型組、金寧方組，每組10 只。于實驗第1、4、7 天給予環磷酰胺（75 mg/kg）腹腔注射誘導小鼠免疫抑制，在第10 天對各組小鼠進行安樂死處理，檢測相關指標。在實驗全程中監測小鼠體質量并觀察實驗動物整體狀況。

2.2 給藥 金寧方為中藥配方顆粒，按金寧方復方比例混合后用純水溶解。按小鼠/人代謝比推算小鼠每日給藥劑量為20 g/kg，灌胃給藥容量為0.1 mL/10 g。從第1 次環磷酰胺注射開始給藥。正常組與模型組給予相同方式的等容量對照溶劑，連續干預10 d。

2.3 外周血細胞檢測 在實驗終點，取各組小鼠全血，并用枸櫞酸鈉進行抗凝處理。通過血細胞分析儀檢測外周血中各血細胞比例，主要關注淋巴細胞數量和血紅蛋白含量。

2.4 脾指數及脾淋巴細胞總數計數 在處死小鼠后，無菌取其脾臟，并對脾臟進行稱重。根據實驗終點小鼠體質量，計算每只實驗動物的脾指數，脾指數＝脾臟質量（mg）/體質量（g）。將脾臟磨碎，過膜，1 200 r/min 離心5 min。棄去上清。沉淀加入紅細胞裂解液每個脾臟約1 mL，混勻，靜置1 min，加入PBS，離心。再加入PBS，過膜，離心。將所剩細胞洗滌1～2 次，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液將細胞懸起，對每份細胞樣品進行活細胞計數，計算每只小鼠的脾臟中免疫相關細胞總數。

2.5 淋巴細胞增殖檢測 將每份細胞樣品的細胞濃度調至4×106/mL。于96 孔板中每孔加入相應體積的各組細胞樣品懸液和有絲分裂原（終濃度為1 μg/mLConA 或2 μg/mL LPS），總體積200 μL。在對金寧方體外效應的評價中，則再加入終濃度為0.32、1.6、8 μg/mL 藥物樣品，并用無藥物干預的絲裂原誘導細胞作為對照組，以細胞培養液（無細胞）為空白組。細胞于含5% CO2、37 ℃培養箱中培養48 h，培養結束前6 h 每孔加入10 μL CCK8 反應試劑。用全波長酶標儀檢測450 nm 處吸光度值（OD），對照組細胞的增殖率為100%，以空白組陰性對照孔的OD作為未增殖本底扣除，歸一化計算并評價金寧方對于淋巴細胞增殖比率的影響。

3 結果

3.1 金寧方能改善免疫抑制小鼠的整體狀況 經環磷酰胺誘導的小鼠表現出活動度下降、體質量減輕、排泄物不成形，甚至體溫下降等整體毒副作用，而經金寧方干預小鼠則在整體水平上均有所改善。通過每日體質量監測發現金寧方能夠明顯緩解環磷酰胺誘導的小鼠體質量減輕，特別在環磷酰胺注射后的緩解期作用明顯，與模型組比較，金寧方組小鼠體質量增加（P＜0.05，P＜0.01）。在實驗終點對血紅蛋白的監測中也能觀察的金寧方恢復血紅蛋白水平的趨勢，但由于個體差異明顯，差異無統計學意義。見圖1～2。

圖1 金寧方對免疫抑制小鼠體質量的影響（n=10）

圖2 金寧方對免疫抑制小鼠血紅蛋白的影響（n=10）

3.2 金寧方明顯緩解免疫抑制小鼠的淋巴細胞數量減少 在針對免疫系統的大體評價中發現，金寧方能夠明顯緩解環磷酰胺引起的脾臟減小，金寧方組脾指數較模型組增加（P＜0.01）。而對脾臟中淋巴細胞總數和外周血淋巴細胞數量的計數中也反應出金寧方對于免疫系統的整體保護作用。見圖3～5。

圖3 金寧方對免疫抑制小鼠脾指數的影響（n=10）

圖4 金寧方對免疫抑制小鼠脾淋巴細胞總數的影響（n=10）

圖5 金寧方對免疫抑制小鼠外周血淋巴細胞的影響（n=10）

3.3 金寧方對于免疫抑制小鼠淋巴細胞增殖反應的促進作用 而各組脾臟淋巴細胞在體外絲裂原誘導條件下，金寧方組與模型組比較也表現出更高的淋巴細胞增殖水平，提示復方對于免疫潛在活性的保護作用，其作用可能與記憶淋巴細胞相關。與體外藥效評價實驗結果一致，金寧方組較ConA 誘導的模型組淋巴細胞增殖率增加（P＜0.05），這可能與金寧方保護細胞免疫效應相聯系?，F代研究已證實，細胞免疫（特別是細胞毒性T 細胞）介導的抗腫瘤作用在癌癥防治中發揮著核心的作用，而金寧方對于肺癌的治療作用中對于免疫保護效應可能與促進了細胞免疫有關。見表1。

表1 不同誘導條件下金寧方對淋巴細胞的影響（，n=7）

表1 不同誘導條件下金寧方對淋巴細胞的影響（，n=7）

注：與正常組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05。

3.4 金寧方具有促進體外淋巴細胞增殖水平效應 金寧方具有促進淋巴細胞增殖效應，且在不同誘導條件下均表現出量效關系，其中無絲裂原條件下促進比例明顯，而在絲裂原誘導條件下作用較緩和，ConA 誘導較LPS 誘導作用更為明顯，提示金寧方可直接活化淋巴細胞，并具有促進淋巴細胞增殖的活性，且對于細胞免疫可能發揮更明顯的作用。見表2。

表2 不同誘導條件下不同濃度金寧方組的淋巴細胞水平（%，，n=3）

表2 不同誘導條件下不同濃度金寧方組的淋巴細胞水平（%，，n=3）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

4 討論

免疫是機體抑制腫瘤發生、生長和轉移的主動調控機制［7］，目前腫瘤的免疫治療日益成為新興的抗癌治療手段，如基于促進細胞毒性T 細胞（CTL）和抑制免疫抑制性膜分子功能的相關藥物正在FDA 開展臨床研究。程小珍等［8］發現晚期肺癌患者CD4+CD25+Treg 的比例顯著高于健康體檢者，表明腫瘤患者CD4+CD25+調節性T 細胞是晚期肺癌患者免疫抑制及腫瘤進展的原因之一。中醫藥在長期的歷史傳承中已被證明其安全性和臨床有效性，特別對于免疫系統的調控作用也不斷被證實具有其相關的藥理作用［9-10］?，F代中藥注射液扶助正氣、培植本元的藥理作用證實調節免疫功能是其抗肺癌的重要作用途徑之一［11］。

中醫認為正氣維系人體正常生命活動，是抗御外邪及防治疾病的基本物質。它的強盛衰敗關系著人體的生命活動及疾病的轉歸。從這個意義上講，中醫學正氣體現了現代醫學的人體免疫功能［12］。人體正氣虛弱導致邪氣乘虛而入，肺失宣肅而致氣血津液輸布不利，體內濕飲凝聚成痰，痰濕與血瘀互結，凝為積聚。與此同時，積聚又加劇了體內氣血津液運行不暢，臟腑失養而致機能不調、免疫低下。

金寧方主要由石上柏、石見穿、干蟾皮、僵蠶、生牡蠣等藥物組成，具有清熱解毒、化痰軟堅之功，被長期用于臨床肺癌病人的治療，并在III 期肺癌術后抗復發轉移中被證明具有積極的作用，能明顯改善中醫臨床癥狀，提高生存質量［13］。據文獻報道，以石上柏組方的加味百合固金湯及金復康口服液均有扶正祛邪、提高免疫功能的作用［14］?，F代藥理學研究證明，干蟾皮提取物華蟾素及牡蠣提取物牡蠣多糖均具有免疫增強作用［15-16］。

本研究基于免疫抑制小鼠模型，初步探討了金寧方對于免疫功能的保護和增強作用的可能機制。在體外研究中，發現金寧方能夠在較低藥物濃度范圍內對淋巴細胞的增殖反應發揮濃度依賴的促進效應。由于復方的體內吸收代謝過程復雜，因此又通過小鼠體內研究同樣證實了金寧方對維持機體整體平衡及淋巴細胞整體水平均具有積極的治療作用。體內外研究同時也顯示金寧方對于免疫系統的保護作用可能更傾向于對T 淋巴細胞反應的保護，這可能提示與藥物的抗腫瘤效應密切相關，達到祛邪與扶正的統一。本次研究主要基于體內免疫抑制的微環境探討金寧方的免疫保護作用，在后期研究中則需通過荷瘤小鼠模型，如原位肺癌模型進一步明確藥物的抗腫瘤效應和藥理作用，特別是對于免疫的調控機制。而復方成分復雜，則需在嚴格藥物質量控制的前提下，通過運用現代高通量研究手段，并結合生物信息分析方法開展復方的綜合藥理研究。在后續研究中，希望通過對金寧方的具體藥物機制闡述為臨床治療提供更明確的科學依據，也為中醫復方研究提供可參考的現代研究模式。