2016-2018年遼寧部分地區豬場豬鏈球菌2型流行病學及大環內酯類耐藥基因攜帶情況調查

劉耀川，高 鋒，郭首龍，李 旭，關 淼，周 維，楊洺揚，申貫男

(1.遼寧省動物疫病預防控制中心，遼寧 沈陽 110164；2.遼寧農業職業技術學院，遼寧 營口 115009)

豬鏈球菌(Streptococcussuis,S.suis)是一類豬群中正常攜帶的人獸共患病原微生物[1]，常見于健康豬的生殖道、消化道及上呼吸道中[2]。S.suis可引起包括豬心內膜炎、腦膜炎、關節炎及人腦膜炎在內的一系列化膿性炎癥[3]。豬鏈球菌血清型眾多，2型仍然是主要致病血清型，此外9型、7型、5型、CHz血清型和部分未定型菌株致病呈上升趨勢。迄今，感染人的血清型增至9種，有2型、5型、9型、14型、16型、21型、24型和31型[4-6]。其中豬鏈球菌2型(Streptococcussuistype 2,SS2)是目前流行范圍最廣、致病性最強的血清型[7]。我國及世界范圍內已有多起因SS2引起的豬群及人感染并死亡的報道，給生豬養殖業及公共衛生安全造成嚴重威脅。大環內酯類抗生素為臨床上治療SS2感染的主要手段之一[8]。但在藥物選擇壓力的作用下耐藥菌株不斷出現，給人類安全及公共衛生造成挑戰。本試驗于2016-2018年，對遼寧地區14個市的19個規?；i養殖場開展為期3年的SS2流行病學調查，并對分離到的SS2分離株進行大環內酯類藥物耐藥基因篩查，為遼寧地區SS2大環內酯類藥物耐藥性分子機制研究及SS2綜合防控提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 2016-2018年于遼寧省14個市選取規?；i養殖場19個，對患敗血癥、關節腫大、呼吸困難、腦炎的病死豬進行樣品采集。

1.1.2 主要試劑 胰蛋白胨大豆瓊脂(Tryptic soy agar，TSA)固體培養基，購自北京奧博星生物技術責任有限公司；2×TaqPCR Master Mix，購自北京全式金生物技術有限公司；pMD20-T vector克隆載體、DL-2 000 DNA Marker，均購自寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa)；細菌基因組DNA提取試劑盒和DNA凝膠回收純化試劑盒，均購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.3 主要儀器 梯度PCR擴增儀(T100 Thermal Cycler，BIO-RAD)、數碼凝膠成像系統(Gel Dox XR+，BIO-RAD)、低溫高速臺式離心機(Biofuge Primo R，Thermo Fisher)、立式高壓滅菌器(SX700，TOMY)等儀器，均由遼寧省動物疫病預防控制中心提供。

1.1.4 引物 根據NCBI中已公布的S.suis16S rRNA基因序列、SS2分型基因cps2J序列及大環內酯類藥物耐藥基因ermA、ermB、ermC及mefA序列，使用Primer 5.0設計特異性引物，并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。具體引物信息見表1。

表1 SS2篩查、定型及大環內酯類藥物耐藥基因檢測引物信息Table 1 Primers information of SS2 screening,typing and macrolide drug resistance gene detection

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 無菌采集關節液、腦、心、肺等組織塊，于4 ℃無菌離心管中保存，并盡快送至遼寧省動物疫病預防控制中心。

1.2.2 病原菌分離 按說明書要求無菌制備含10%脫纖維兔血的TSA固體培養基，待其凝固后于37 ℃過夜檢菌。在潔凈工作臺中，用鑷子取采樣組織塊，或用無菌棉拭子蘸取關節液，并均勻涂布于檢菌合格的TSA血平板中，于37 ℃倒置培養18 h。挑取灰白色且有溶血環的單獨小菌落于5 mL無菌營養肉湯中，37 ℃ 180 r/min振蕩培養12 h。于同一病例不同組織中分離到的菌株，作為1個分離株進行統計。

1.2.3 基因組DNA提取及S.suis分離株鑒定 按基因組DNA提取試劑盒說明書操作要求，提取初步分離的S.suis分離株基因組DNA，并以其為模板對16S rRNA進行PCR擴增。產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后回收，并與pMD20-T vector克隆載體連接，送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行序列測定。經BLAST序列比對后，確定S.suis分離株。PCR反應體系：2×TaqPCR Master Mix 25 μL、上下游引物各1 μL、模板DNA 1 μL、ddH2O 22 μL，體系總體積50 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性10 min；94 ℃變性40 s,可變退火溫度30 s,72 ℃延伸45 s～1 min，重復35個循環；72 ℃最終延伸7 min；4 ℃保存。

1.2.4 SS2 PCR鑒定 使用SS2定型引物，以S.suis分離株基因組DNA為模板，對SS2進行PCR鑒定。PCR反應體系及條件同1.2.3。擴增產物經測序、比對后，最終確定SS2分離株。

1.2.5 大環內酯類藥物耐藥基因篩查 以SS2分離株基因組DNA為模板，對其大環內酯類藥物耐藥基因攜帶情況進行PCR篩查。具體方法同1.2.3。

2 結果

2.1S.suis初步分離及SS2鑒定結果

2.1.1 樣品采集及S.suis初步分離 2016-2018年課題組于受試養殖場共采集發病豬、死豬樣品2 251份(2016-2018年分別為792份、626份和833份)。樣品經TSA血液培養基培養，初步分離S.suis分離株1 851株(2016-2018年分別為622株、537株和692株)。

2.1.2S.suis分離株16S rRNA鑒定 以初步分離的S.suis分離株基因組DNA為模板，對其16S rRNA進行擴增。經序列測定及比對，確定S.suis分離株1 159株(2016-2018年分別為391株、306株和462株)，其樣品分離率為51.5%(1 159/2 251)。2016-2018年分離率分別為49.4%(391/792)、48.9%(306/626)和55.5%(462/833)。部分S.suis分離株16S rRNA PCR擴增結果見圖1。

圖1 部分S.suis分離株16S rRNA電泳結果Fig.1 The electrophoresis results of 16S rRNA obtained from S.suisM:DL-2 000 DNA Marker；1～6:S.suis分離株M:DL-2 000 DNA Marker；1～6:S.suis isolates

2.1.3 SS2分離株分型鑒定 以經序列比對確定為S.suis分離株的基因組DNA為模板，利用特異性引物對SS2分型基因cps2J進行PCR擴增，經測序、比對確定SS2分離株451株(2016-2018年分別為152株、106株和193株)。SS2在S.suis分離株中占比及樣品分離率分別為38.9%(451/1 159)和20.0%(451/2 251),2016-2018年占比及樣品分離率分別為38.9%(152/391)、19.2%(152/792)；34.6%(106/306)、16.9%(106/626)；41.8%(193/462)和23.2%(193/833)。部分cps2J基因PCR擴增結果見圖2。

圖2 部分SS2分型基因cps 2J電泳結果Fig.2 The electrophoresis results of cps 2J gene obtained from SS2M:DL-2 000 DNA Marker；1～4:cps2J基因M:DL-2 000 DNA Marker；1～4:cps2J gene

2.2 大環內酯類藥物耐藥基因篩查結果

2.2.1 分離株耐藥基因攜帶情況 在451株SS2分離株中，共有255株攜帶不同類型的大環內酯類藥物耐藥基因，菌株陽性率為56.5%(255/451)。其中234株為僅攜帶1種耐藥基因的菌株，占比51.9%(234/451)；21株分離株同時攜帶2種耐藥基因，占比4.7%(21/451)；未發現同時攜帶3種及3種以上耐藥基因的分離株。

共有87株分離株僅攜帶ermA基因，占比19.3%(87/451)；66株分離株僅攜帶ermB基因，占比14.6%(66/451)；81株分離株僅攜帶mefA基因，占比18.0%(81/451)；16株分離株同時攜帶ermA和mefA基因，占比3.5%(16/451)；5株分離株同時攜帶ermB和mefA基因，占比1.1%(5/451)。

2.2.2 耐藥基因篩查 篩查共獲得大環內酯類耐藥基因276個，其中ermA、ermB和mefA基因占比分別為37.3%(103/276)、25.7%(71/276)和37.0%(102/276)，未檢測到ermC基因。

按年份分析ermA、ermB和mefA基因篩查結果，2016年上述3種基因的占比分別為41.2%(42/102)、22.5%(23/102)和36.3%(37/102)；2017年為33.6%(27/80)、23.8%(19/80)和42.5%(34/80)；2018年為36.2%(31/94)、30.9%(29/94)和33.0%(31/94)。具體耐藥基因篩查結果見表2。部分耐藥基因PCR擴增結果見圖3。

表2 耐藥基因篩查結果Table 2 The screening results of drug resistance gene

圖3 部分大環內酯類藥物耐藥基因電泳結果Fig.3 The electrophoresis results of some macrolides resistance geneM:DL-2 000 DNA Marker；1～2:ermA基因；3～4:ermB基因；5～6:mefA基因M:DL-2 000 DNA Marker；1～2:ermA gene；3～4:ermB gene；5～6:mefA gene

3 討論

目前SS2是世界范圍內主要流行的血清型，作為健康豬的常在病原菌，其對生豬養殖業及從業人員的健康造成嚴重威脅。近年來，已有多例人感染SS2引起死亡的病例報道，SS2已成為重要的公共衛生安全隱患[9-11]。本試驗對遼寧地區19個規?；i養殖場進行3年的SS2流行病學調查，結果表明，SS2占總分離S.suis的38.9%。近期報道中，該分離率為10.0%～53.3%不等。如徐引弟等[7]于2016年對河南地區調查發現，SS2占總S.suis分離株的46.0%；趙戰勤等[5]于2011-2015年對河南及周邊省份進行調查發現，SS2占總S.suis分離株的53.3%；劉琪等[12]廣東地區調查發現，SS2占比為16.58%；王娟等[9]在廣州地區健康豬群中調查發現，S.suis攜帶率為33.81%，其中SS2占比8.82%；徐魁等[8]對四川地區SS2進行流行病學調查，結果表明，四川地區SS2總體陽性率為40.3%，81.8%的受調查規?；B殖場均為SS2陽性；楊春蕾等[13]在天津地區調查發現，SS2的樣品陽性率為3.5%；董志民等[14]對我國多地區流行病學調查發現，SS2占比為24.4%。本試驗結果與報道數據相比，在樣品分離率及在總S.suis分離株中占比均屬于相對較高水平，表明遼寧地區規?；i養殖場中SS2流行情況相對較高。

本試驗對451株SS2分離株4種大環內酯類藥物耐藥基因攜帶情況進行篩查，結果表明，共有103株(87株僅攜帶ermA基因及16株同時攜帶ermA、mefA基因)為ermA基因陽性株，占比22.8%(103/451)；71株(66株僅攜帶ermB基因及5株同時攜帶ermB、mefA基因)為ermB基因陽性株，占比15.7%(71/451)；102株(81株僅攜帶mefA基因及21株同時攜帶2種耐藥基因)為mefA陽性株，占比22.6%(102/451)，未檢出ermC基因。孫佳楠等[15]報道，在遼寧西部豬源SS2中，ermA、ermB、ermC和mefA基因的檢出率分別為53.3%、76.1%、0%和5.43%；芮萍等[16]報道，河北地區豬源SS2ermB、ermA檢出率分別為98.0%和25.5%，未檢出mefA基因；黃金虎等[11]對江蘇、江西等地調查發現，其ermB、mefA基因陽性率分別為26.1%和8.7%。與報道數據比較，受試飼養場SS2分離株在耐藥基因種類及陽性率方面均有所不同，可能與地區間用藥習慣、治療方案不同有關，同時不同地區病原菌間耐藥性傳遞機制差異也可能對耐藥基因攜帶結果存在影響。