豬繁殖與呼吸綜合征病毒和豬鼻支原體雙重PCR檢測方法的建立

修曉娜，李天芝，于新友

(1.中國農業大學煙臺研究院，山東 煙臺 264670；2.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600)

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)能感染豬引起豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)[1]。PRRS臨床表現主要為母豬繁殖障礙及生長豬呼吸道癥狀[2-4]。PRRSV感染豬后，導致豬免疫系統受損，形成免疫抑制，從而繼發各種疾病，致豬死亡率增加[5]。豬鼻支原體(Mycoplasmahyorhinis，Mhr)感染豬后能引起豬肺炎、關節炎、多發性漿膜炎、中耳炎、結膜炎等多種疾病[6]，3～10周齡仔豬多發[7]，與其他豬病混合感染后，加重病情[8]。Mhr是豬鼻腔、氣管、支氣管黏液中的常在菌，10%母豬和40%斷奶仔豬呼吸道黏液中均有該菌存在[9]。近年來，Mhr引起的疾病增加，對豬場危害嚴重[10-11]。Mhr和PRRSV常發生混合感染，導致豬發病嚴重[12]。有必要建立一種快速、準確、同時檢測PRRSV 和Mhr的方法，以便及時采取合理措施進行科學防控。筆者根據PRRSVORF7和MhrP37基因序列設計引物，建立了同時檢測2種病原的方法，并應用于臨床病料檢測，報告如下。

1 材料與方法

1.1 菌毒株及檢測樣品 豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬圓環病毒2型(PCV2)、偽狂犬病病毒(PRV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬鼻支原體(Mhr)、豬胸膜肺炎放線桿菌(APP)、豬肺炎支原體(Mhp)、副豬嗜血桿菌(Hps)、豬鏈球菌(S.suis)由本實驗室保存；大腸桿菌感受態DH5α，購自百泰克生物科技有限公司；臨床檢測樣品為2018年1月-2018年11月采自魯北地區豬場疑似PRRSV和Mhr感染的豬肺臟組織。

1.2 主要試劑 AxyPrep體液病毒核酸小量提取試劑盒，購自愛思進生物技術(杭州)有限公司；Premix Tag、PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2，購自寶生物工程(大連)有限公司；DNA Marker DL-2 000，購自百泰克生物科技有限公司；細菌基因組提取試劑盒、高純質粒小量制備試劑盒和多功能DNA純化回收試劑盒，均購自北京百泰克生物科技有限公司；pMD18-T載體，購自生工生物工程(上海)股份有限公司；LB液體培養基、1×TAE電泳緩沖液，均由本實驗室配制。

1.3 引物的設計與合成 應用DNASTAR軟件分別對GenBank中收錄的PRRSVORF7基因和MhrP37基因序列進行分析比對后，分別設計1對特異性引物，引物由通用生物系統(安徽)有限公司合成，引物序列信息見表1。

表1 PCR引物Table 1 PCR Primer

1.4 病原核酸提取 分別吸取PRRSV、CSFV、PCV2、PRV共4種病毒液200 μL，按照病毒核酸提取試劑盒的說明書提取病毒核酸，最后用40 μL洗脫液洗脫。分別吸取Mhr、Mhp、APP、Hps、S.suis共5種菌液，按照試劑盒說明書提取細菌基因組DNA，最后用100 μL洗脫液洗脫，-20 ℃保存備用。

1.5 單項PCR檢測方法的建立 首先用無核酸酶滅菌純化水分別稀釋引物PRRSV-F、PRRSV-R和Mhr-F、Mhr-R，使得其終濃度均15 μmol/L，分別以PRRSV-F和PRRSV-R為引物，PRRSV RNA為模板，Mhr-F和Mhr-R為引物，Mhr基因組DNA為模板，優化反應條件，建立了PRRSV和Mhr單項PCR檢測方法。

1.6 雙重PCR檢測方法的建立 按照OneStep RT-PCR Kit Ver.2說明書進行反應體系的配制，總體系20 μL，其中2×1 Step Buffer 10 μL，PrimeScriptTMOne Step Enzyme Mix 0.8 μL，PRRSV RNA 1 μL，Mhr基因組DNA 1 μL，引物在反應體系中的加入量不斷優化，并用水補充剩余體系，瞬時離心后，放入 PCR儀進行擴增反應，反應擴增程序為：反轉錄50 ℃ 30 min，預變性 95 ℃ 3 min，變性95 ℃ 25 s，退火55 ℃ 25 s，延伸72 ℃ 30 s，35個循環。分別采用48～60 ℃的退火溫度(每次遞增1 ℃)。篩選最佳引物加入量和最佳退火溫度。

1.7 特異性試驗 分別取PRRSV和Mhr核酸1.0 μL，混合后作為PCR反應模板，另取PRRSV、Mhr、CSFV、PCV2、PRV、Mhp、APP、Hps、S.suis核酸各2 μL。采用本試驗建立的PRRSV和Mhr雙重PCR方法進行擴增，反應結束后以1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，以確定所建方法的特異性。

1.8 敏感性試驗 分別回收1.6中PRRSV和Mhr擴增產物234 bp和737 bp目的基因片段，連接pMD18-T載體后，轉化大腸桿菌感受態DH5α，37 ℃過夜培養，挑取單菌落接種LB液體培養基，提取質粒后，并送測序公司進一步驗證，測序正確后，紫外分光光度計測定質粒濃度以及純度，作陽性標準品，分別作10倍倍比梯度系列，取相應稀釋度等量混合，用優化后PCR檢測方法進行雙重PCR擴增，1.5%瓊脂糖凝膠電泳PCR產物，確定方法的敏感性。

1.9 重復性試驗 分別選取6份確定為PRRSV細胞毒和4份確定為Mhr培養液，提取核酸后，采用本試驗建立的PRRSV和Mhr雙重PCR進行檢測，每種樣品均重復3次，以確定方法的穩定性和重復性是否良好。

1.10 臨床樣品的檢測 從魯北地區豬場采集疑似PRRSV、Mhr感染病例的肺臟作為病料樣品，共采集85份病料樣品。病料樣品處理后，提取總核酸，采用所建方法進行PRRSV和Mhr的檢測，并同時進行單項PCR檢測，比較檢測結果。

2 結果

2.1 PRRSV和Mhr單項PCR檢測方法的建立 PRRSV單項PCR的引物加入量為1.5 μL PRRSV-F(15 μmol/L)、1.0 μL PRRSV-R(15 μmol/L)，反應程序為：反轉錄50 ℃ 30 min，預變性 95 ℃ 30 min，變性95 ℃ 15 s，退火54 ℃ 20 s，延伸72 ℃ 20 s，35個循環。Mhr單項PCR引物加入量為0.8 μL Mhr-F(15 μmol/L)、2.1 μL Mhr-R(15 μmol/L)。反應程序為：預變性 95 ℃ 30 min，變性95 ℃ 10 s，退火52 ℃ 20 s，延伸72 ℃ 30 s，35個循環。

2.2 雙重PCR檢測方法 通過不斷優化反應體系中引物加入量和擴增反應程序，最終確定的PRRSV和Mhr雙重PCR檢測方法的最佳引物的加入量為1.2 μL PRRSV-F(15 μmol/L)、1.4 μL PRRSV-R(15 μmol/L)、0.6 μL Mhr-F(15 μmol/L)、1.8 μL Mhr-R(15 μmol/L)。優化后最佳的擴增反應程序為：反轉錄50 ℃ 30 min，預變性 95 ℃ 30 min，變性95 ℃ 15 s，退火53 ℃ 20 s，延伸72 ℃ 30 s，35個循環。

2.3 特異性試驗 采用建立的雙重PCR方法對PRRSV+Mhr、PRRSV、Mhr、CSFV、PCV2、PRV、APP、Mhp、Hps、S.suis核酸擴增，結果顯示，PRRSV+Mhr可擴增2條特異性基因片段，大小約234 bp和737 bp，以單一的PRRSV核酸為模板時擴增出1條特異性基因片段，大小約234 bp，以Mhr DNA為模板時可擴增出約737 bp基因片段，而CSFV、PCV2、PRV、APP、Mhp、Hps、S.suis核酸，則無任何擴增條帶，說明所建立的方法特異性好(圖1)。

2.4 敏感性試驗 分別根據PRRSV和Mhr質粒標準品濃度計算拷貝數，PRRSV和Mhr質?？截悢捣謩e為4.2×1010拷貝/μL和1.8×1010拷貝/μL。PRRSV質粒稀釋為4.2×109、4.2×108、4.2×107、4.2×106、4.2×105、4.2×104、4.2×103、4.2×102拷貝/μL和4.2×101拷貝/μL共9個不同的稀釋度。Mhr質粒稀釋為1.8×109、1.8×108、1.8×107、1.8×106、1.8×105、1.8×104、1.8×103、1.8×102拷貝/μL和1.8×101拷貝/μL共9個不同的稀釋度，分別取108～101拷貝/μL的PRRSV和Mhr質粒標準品，同等稀釋度等量混合后作為模板。用雙重PCR方法進行擴增，結果顯示，該法對PRRSV的最低檢測限度為420 拷貝/μL，對Mhr的最低檢測限度為180 拷貝/μL(圖2)，與單項PCR檢測敏感性一致(圖3，圖4)，表明所建方法具有很好的敏感性。

圖1 特異性試驗Fig.1 Specificity determinationM：DL-2 000 DNA相對分子量標準;1：PRRSV和Mhr;2：PRRSV；3：Mhr;4：CSFV;5：PCV2;6：PRV;7：APP;8：Mhp;9：Hps;10：S.suisM：DL-2 000 DNA Marker;1：PRRSV and Mhr;2：PRRSV;3：Mhr；4：CSFV;5：PCV2;6：PRV;7：APP;8：Mhp;9：Hps;10：S.suis

圖2 雙重PCR敏感性試驗Fig.2 Sensitivity determination of the duplex PCRM：DL-2 000 DNA相對分子量標準;1～8：PRRSV和Mhr質粒標準品拷貝數分別為108～101 拷貝/μLM：DL-2 000 DNA Marker;1～8：The copies of PRRSV and Mhr plasmids were 108～101 copies /μL

圖3 PRRSV單項PCR敏感性試驗Fig.3 Sensitivity determination of PRRSV single PCRM：DL-2 000 DNA相對分子量標準；1～8：PRRSV質粒標準品拷貝數分別為108～101 拷貝/μLM：DL-2 000 DNA Marker；1～8：The copies of PRRSV plasmids were 108～101 copies /μL

2.5 重復性試驗 用核酸提取試劑分別提取6份 PRRSV細胞毒和4份Mhr培養液核酸，以所建立的雙重PCR檢測方法檢測，并重復3次，結果顯示，3次結果一致，均為陽性，表明所建方法穩定性好。

2.6 臨床樣品的檢測 對采集的85份臨床疑似PRRSV、Mhr感染肺臟樣品，分別用PRRSV和Mhr雙重PCR進行檢測，并且每份核酸同時做PRRSV單項PCR、Mhr單項PCR檢測，檢測結果分析，雙重PCR和單項PCR的檢測結果一致，符合率為100%，共檢測PRRSV陽性樣品25份，Mhr陽性樣品13份，其中6份為PRRSV和Mhr混合感染樣品(表2)，表明所建立的雙重PCR檢測PRRSV和Mhr效果好，可用于臨床樣品的檢測。

圖4 Mhr單項PCR敏感性試驗Fig.4 Sensitivity determination of Mhr single PCRM：DL-2 000 DNA相對分子量標準;1～8：Mhr質粒標準品拷貝數分別為108～101 拷貝/μLM：DL-2 000 DNA Marker;1～8：The copies of PRRSV plasmids were 108～101 copies /μL

表2 單項PCR與雙重PCR檢測對比試驗結果Table 2 The results of single PCR and double PCR detection comparative test

3 討論

自2006年高致病性PRRSV暴發以來，PRRS成為影響我國養豬業發展的重要疾病之一[13]。隨著疫苗的廣泛應用，豬場PRRSV每年都在發生變異，但發生變異的基因主要是NSP2基因[14]，當前豬場呈現PRRSV多毒株共存的局面，PRRSV的防控工作變得更復雜[15]。本試驗根據PRRSV變異小的ORF7基因設計引物，能覆蓋豬場各種類型PRRSV毒株，避免漏檢。PCR檢測為PRRSV陽性時并不能說明豬場暴發PRRS，要得出可靠的結果還需要根據豬場PRRS疫苗的免疫情況和豬場的狀態，有時還需要配合病理切片，才能做出科學的判斷。不同PRRS疫苗有不同帶毒和排毒期，當豬場不穩定，豬群有PRRS相關癥狀和病變，同時PCR檢測為PRRSV核酸陽性時，可以按PRRS暴發采取相應緊急防控措施。

豬支原體病主要由肺炎支原體、滑液支原體和Mhr等3種支原體引起[16]，3種支原體間交叉保護性差。目前豬肺炎支原體有商品化的滅活疫苗和活疫苗，在豬肺炎支原體病的防控中發揮了很好的作用?；褐гw主要影響大豬，發生關節病變，一般不會致死豬，Mhr可導致豬呼吸道疾病，1～3月齡豬多發，沒有疫苗預防[17]，因此，豬場必須重視。對Mhr引起的疾病，雖可用林可霉素、大環內酯類藥物治療，但容易產生耐藥性，效果不理想[18]。只能采取綜合性防控措施，如加強飼養管理，提高豬只機體抗病力。飼喂優質飼料，禁止喂霉變飼料。豬舍做好保溫和通風工作，保持豬舍清潔衛生，做好消毒工作，定期通風、降低氨氣濃度、減少飼養密度、減少應激以降低Mhr相關疾病發病率和病情的嚴重程度。

筆者根據PRRSVORF7基因和Mhr最為保守的種屬基因P37基因，分別設計1對特異性引物，優化體系中引物加入量和反應程序，首次建立了PRRSV和Mhr雙重PCR檢測方法，對PRRSV和Mhr的最低檢測限度分別為420 拷貝/μL和180 拷貝/μL，與單項PCR檢測，敏感性一致，說明同一體系中擴增2種病原并未產生嚴重抑制作用，具有較高的靈敏性，大大簡化了操作步驟，節約了時間，提高了檢測效率。在病料檢測中有一些創新，更加實用，按以往的觀念需要PRRSV提取RNA、豬支原體提取DNA，并分開進行擴增，操作非常繁瑣，不但需要提取2種核酸，擴增時還需要分開加樣，分開擴增，需要時間長，或同時占用2臺PCR儀器。而筆者進行了創新，病料研磨后，1 000 r/min低速離心，保證大的組織塊下沉，而上清內含病毒和支原體，后用吸附柱式法同時提取PRRSV和Mhr核酸，配合小型高速離心機，操作簡便，半小時內即能提完核酸，提取的核酸質量較高，能達到PCR反應的質量要求，不存在PCR反應抑制物，且所有試劑均能常溫保存和運輸。通過對85份臨床疑似病料樣品檢測結果顯示，所建立的PRRSV和Mhr雙重PCR和單項PCR結果一致，符合率為100%，說明所建方法檢測臨床樣品效果好。下一步筆者打算將除模板外試劑凍干，適合常溫保存和運輸，使用時只要加入滅菌水和模板即能進行擴增反應，進一步簡化加樣步驟，使得病原檢測更便捷。