北京地區腹瀉犬、健康犬糞便糞腸球菌耐藥性、毒力基因及多位點序列分型研究

李金鑫，高一丁，婁銀瑩，黃克斌，于 飛，張穎欣，于詠蘭

(中國農業大學動物醫學院，北京 海淀 100193)

糞腸球菌(Enterococcusfaecalis,E.faecalis)是包括犬在內的多種哺乳動物腸道共生菌，也是重要的院內感染病原。在人醫臨床，糞腸球菌引起感染占腸球菌性感染的60%～75%[1]，常見感染類型包括心內膜炎、口腔感染、創口感染、血液循環系統、泌尿系統的感染[2]，近年來國內已有動物由糞腸球菌引起感染的病例出現[3-4]。腸球菌基因重組的方式較多，包括突變積累、插入序列、轉座子誘導和信息素質粒介導重組等[5]，大量耐藥基因和毒力基因在種群內得以廣泛水平傳播[6]。犬出現腹瀉癥狀時，多數臨床獸醫師會首選廣譜抗生素進行治療，在英國獸醫臨床被首先給予抗生素治療的腹瀉犬比例達71%[7]，而抗生素對腸道菌群施加的選擇壓力會提高具有耐藥特性的腸球菌成為腸道優勢菌種的可能，且腸球菌對宿主體外高滲透壓、高溫環境以及部分醫用酒精消毒劑具有較強的耐受性[2]，因而隨糞便排出的此類腸球菌可能引起動物機體其他部位感染，或向包括人在內的其他動物水平傳播，具有公共衛生安全隱患。本文通過研究中國農業大學教學動物醫院收集的45株腹瀉犬糞便源糞腸球菌、32株健康犬糞便源糞腸球菌的耐藥性，指導臨床用藥，同時采用多位點序列分型(Multiloucs sequence typing,MLST)方法對糞腸球菌進行分子分型，分析不同糞便來源優勢序列型(Sequence type,ST)糞腸球糞毒力基因攜帶情況。

1 材料與方法

1.1 對象 本試驗用于收集糞腸球菌的犬均來源于從北京各地區至中國農業大學教學動物醫院就診或者接受疫苗免疫的犬只。腹瀉犬為有腹瀉癥狀且至少15 d內未使用任何抗生素的犬只；健康犬為進行免疫注射且實驗室常規檢查結果為正常的犬只。采集腹瀉犬、健康犬肛拭子糞便樣本，通過分離培養共得到腹瀉犬來源糞腸球菌45株，健康犬來源糞腸球菌32株，質控菌株為由實驗室保存的ATCC25922和ATCC29213。

1.2 方法

1.2.1 藥物敏感性檢測 采用瓊脂稀釋法檢測糞腸球菌對抗菌藥物的最小抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration,MIC)，檢測的抗生素包括萬古霉素、青霉素、氨芐西林、阿莫西林克拉維酸、氯霉素、呋喃妥因、高濃度慶大霉素(500 μg/mL)、紅霉素、米諾環素、多西環素、四環素、利福平，藥敏結果判讀根據美國國立臨床標準實驗室委員會(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)2018年M100手冊要求。

1.2.2 DNA提取 將單菌落接種于1.5 mL LB肉湯培養基，37 ℃，2 500 r/min震蕩4 h，然后使用商品化的核酸提取試劑盒(Tiangen?DNA Kit)提取DNA。

1.2.3 MLST分子分型 7個管家基因(gdh、gyd、pstS、gki、aroE、xpt、yqil)的引物序列參照糞腸球菌MLST在線數據庫(http://efaecalis.mlst.net/misc/info.asp)由美吉生物(北京)公司合成，根據該數據庫提供的反應體系、反應條件對管家基因進行PCR擴增，擴增產物交由美吉生物(北京)公司測序。測序結果上傳至糞腸球菌MLST在線數據庫比對分析，獲取每株分離菌7個管家基因等位基因編號，根據等位基因編號得出ST，并使用eBURST軟件進行聚類分析。

1.2.4 毒力基因檢測 利用PCR檢測優勢ST糞腸球菌agg、gelE、cylB、esp、efaAfs共5種毒力基因攜帶情況。以1.2.2中提取的DNA為模板，引物序列見表1[8]，PCR反應條件為94 ℃ 2 min；92 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，循環30次；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。

2 結果

2.1 糞腸球菌耐藥性 腹瀉犬源和健康犬源糞腸球菌對四環素、多西環素、米諾環素、紅霉素、利福平耐藥率較高。腹瀉犬源分離株對氯霉素、氨芐西林、阿莫西林克拉維酸、呋喃妥因耐藥率較低，集中于8.9%～17.8%，對萬古霉素耐藥率為0；健康犬源分離株對青霉素、呋喃妥因耐藥率較低，分別為4.8%和14.3%，對氨芐西林、阿莫西林克拉維酸、萬古霉素耐藥率為0。所有菌株的具體耐藥情況見表2和圖1。

表1 毒力基因及其引物Table 1 Virulence genes and primers

表2 不同來源糞腸球菌的耐藥性Table 2 Drug resistance of E.faecalis isolated from different sources

圖1 不同來源糞腸球菌的耐藥性Fig.1 Drug resistance of E.faecalis isolated from different sources

所有糞腸球菌無萬古霉素耐藥菌株，45株腹瀉犬來源的糞腸球菌中有5株(11.1%)對5類抗菌藥物均敏感，其余分離株耐藥譜主要集中于3耐和4耐，多重耐藥率為91.1%(41/45)；32株健康犬來源糞腸球菌有8株(25.0%)對5類抗生素耐藥，其余分離株耐藥譜集中于2～4耐，多重耐藥率為75.1%(24/32)。腹瀉犬來源與健康犬來源糞腸球菌對本試驗所選12種抗微生物藥物耐藥率差異不顯著(P>0.05)。

2.2 糞腸球菌MLST分型 45株腹瀉犬源糞腸球菌共發現15種ST，優勢ST為ST116、ST16、ST179，32株健康犬源糞腸球菌發現18種ST，優勢ST為ST16和ST27。ST型具體分布見中插彩版圖2和圖3。

通過查閱以往研究，糞腸球菌克隆復合群(Clone complex,CC)16是重要的人院內感染病原性糞腸球菌復合群[9]，eBURST軟件分析結果顯示，腹瀉犬來源優勢ST糞腸球菌中ST16、ST179共13株(24.4%，11/45)屬于CC16，健康犬來源優勢ST糞腸球菌中ST16屬于CC16，數量占腹瀉犬來源分離株21.9%(7/32)。

2.3 優勢ST糞腸球菌毒力基因檢測 優勢ST糞腸球菌毒力基因檢測結果見表3。在2種來源的糞腸球菌中均檢測到agg、gelE、cylB、esp、efaAfs共5種毒力基因，16株腹瀉犬來源優勢ST菌株中有2株不攜帶全部5種毒力基因，檢出率為87.5%(14/16)，健康犬來源優勢ST糞腸球菌檢出率為75%(9/12)。不同來源糞腸球菌5種毒力基因陽性率差異不顯著(P>0.05)。

表3 不同來源優勢ST型糞腸球菌毒力基因陽性率Table 3 Prevalence of virulence genes among E.faecalis with predominant ST isolated from different sources

3 討論

目前國內外鮮有關于腹瀉犬與健康犬腸球菌耐藥情況對比的研究，Kwon K H等[10]在韓國進行的一項關于健康警犬糞便中糞腸球菌的研究顯示，分離株對氨芐西林、氯霉素敏感，對紅霉素耐藥率為10%，對鏈霉素、奎奴普丁、鏈霉素耐藥率均超過80%，多重耐藥率為61.8%，氨芐西林耐藥結果和本研究相似。Leener E D等[11]采集犬臨床分離糞腸球菌，耐藥檢測結果顯示，分離株對氯霉素、高濃度慶大霉素(500 μg/mL)耐藥率分別為85%和79%，對四環素和鏈霉素耐藥率為19%和10%，多重耐藥率為34.3%，和本試驗耐藥率結果存在差異，表明不同地區抗生素的使用和管理策略可能會對糞腸球菌耐藥率產生影響。

糞腸球菌克隆復合群(Clonal complex,CC)指由某一祖先ST糞腸球菌進化而來的所有ST糞腸球菌集合群，同一CC內糞腸球菌遺傳進化親緣性相近。糞腸球菌CC16以ST16糞腸球菌為祖先ST菌，是人醫臨床院內感染病原性糞腸球菌常見CC。Dai D等[12]采集的重癥監護病人感染處樣本糞腸球菌分離菌株中，CC16糞腸球菌分離率為41.7%，越南一項有關人醫臨床泌尿道感染病原篩查研究中，CC16糞腸球菌分離率達51.6%[13]，丹麥研究人員在患心內膜炎人和豬的血液中均分離到CC16糞腸球菌[14]，并通過對人和豬來源CC16糞腸球菌毒力基因和毒力表型的對比發現2種來源分離株在致病力特性上無顯著差異，表明存在人醫臨床常見致病性糞腸球菌在動物與人之間水平傳播的可能，本試驗中腹瀉犬、健康犬來源優勢ST糞腸球菌CC16菌株分別占24.4%和21.9%，提示犬糞便中糞腸球菌可能是人糞腸球感染病原。

在2種來源的糞腸球菌中均檢測到agg、gelE、cylB、esp、efaAfs共5種毒力基因，5種毒力基因對應的陽性率差異不顯著(P>0.05)。朱娜等[15]對湖南患流行性腹瀉、健康豬糞便中腸球菌毒力基因檢測結果顯示，除gelE基因在健康豬源腸球菌陽性率(9.4%)高于患流行性腹瀉豬源分離株陽性率(2.6%)，其余包括ace、agg、cylA、efaA在內的毒力基因PCR檢測陽性率均表現為腹瀉豬糞便中分離株更高，且差異顯著(P<0.05)。吳敏[16]對人醫臨床來源和健康人來源糞腸球菌毒力基因PCR檢測結果顯示，efaAfs、cylA、esp、agg、ace、gelE共6種基因在臨床源分離株中檢測陽性率高于健康人源分離株，且esp、agg、ace、gelE陽性率在2種來源分離株差異極顯著(P=0.00)，吳敏的研究中以人臨床感染部位分離糞腸球菌與健康人群分離糞腸球菌相對比，本試驗中腹瀉犬糞便分離糞腸球菌可能并非是引起腹瀉的原發病原，這是腹瀉犬與健康犬糞源糞腸球菌毒力基因攜帶情況差異不顯著的可能原因。