HPLC-MS/MS法分析刺參及其制品中海參多糖的含量

焦健， 朱振軍， 佟志晏，馬俊杰，辛丘巖，張彤彤，李凌霄，孫娜，宋爽*

(1.北京同仁堂健康(大連)海洋食品有限公司， 遼寧 大連 116045; 2.大連工業大學食品學院， 國家海洋食品工程技術研究中心，海洋活性多糖開發應用技術國家地方聯合工程實驗室， 遼寧 大連 116034; 3.廣西大學輕工與食品工程學院， 廣西 南寧 530004)

海參是中國的傳統補益食品。其中，刺參(Apostichopusjaponicus)是中國養殖量最大的海參品種，其市場認可度高，價格也較高。但目前市場上刺參產品質量參次不齊，存在以次充好的現象。海參多糖是海參的重要營養功效成分，大量研究證實，海參多糖具有抗血栓、降血脂、增強免疫、抗腫瘤及調節腸道菌群等多種功效[1-5]。海參多糖主要包括巖藻糖基化硫酸軟骨素和巖藻聚糖硫酸酯[6-7]。目前刺參中多糖含量的數據有限[8]，還未見對海參多糖含量影響因素研究的報道，因此有必要獲得更多刺參及其制品中海參多糖的含量數據，并研究養殖地、養殖方式對海參多糖含量的影響，為刺參產品的質量控制和品質提升提供參考。

速發海參是近年盛行的一種新工藝，其優勢是泡發時間短、流程簡單快捷，深受廣大消費者喜愛，而目前并未有相關文獻對速發海參多糖含量的報道。針對上述問題，本研究依據水產行業標準(SC/T 3049—2015)的方法[9]，通過高效液相色譜-三重四極桿質譜聯用技術(HPLC-MS/MS)對采集自大連4個不同養殖地的4批次共16份海參樣本中的海參多糖含量進行分析測定，比較了養殖地對海參多糖含量的影響，分析了速發海參產品的多糖含量及其與海參原料中多糖含量的相關性，并測定了大連和山東地區46批次海參樣品的多糖含量數據，旨在為海參多糖含量研究及相關標準制修訂提供參考依據。

1 實驗

1.1 材料與儀器

1.1.1 海參

本實驗所用海參樣本均為刺參(Apostichopusjaponicus)，每份樣本包括5～10只海參，每只新鮮海參重量范圍為100～200 g。

考察養殖地對海參多糖含量影響的實驗中，從4個養殖地(1#～4#)采集了生鮮刺參樣本，4個養殖地均在大連地區，具體地點為皮口平島(1#)、瓦房店沙山(2#)、瓦房店沙坨子(3#)和鹽場(4#)，其中1#和2#為圈養養殖，3#和4#為底播養殖。在2016年10月至2017年5月間從每個養殖地采集4批生鮮海參，共計16份生鮮海參樣本。

研究速發海參多糖含量的實驗中，將采集自1#～4#養殖地的16份生鮮海參分別加工成速發海參，用于檢測分析。速發海參加工由北京同仁堂健康(大連)海洋食品有限公司完成。

在海參多糖含量數據積累與分析實驗中，又從46個不同的養殖地各采集了一份生鮮海參樣本。這46個養殖地包括大連地區圈養養殖地4個，底播養殖地8個；山東(包括威海、煙臺、東營和日照等)地區圈養養殖地16個，底播養殖地18個。采集時間為2016年10月至2017年6月。另外整合了1#～4#養殖地的16份生鮮海參的檢測數據，共使用了62份生鮮海參的數據。

1.1.2 試劑與設備

木瓜蛋白酶購自生工生物工程(上海)股份有限公司。巖藻糖(純度≥99%)和乳糖(純度≥99%)購自Sigma公司。乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、半胱氨酸鹽、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)、乙酸鉀和甲醇均購自天津市大茂化學試劑廠。其他試劑均為分析純。Seven Compact pH計購自梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。臺式冷凍離心機購自Thermo Scientific公司。LC-10AD/4000QTRAP串聯質譜儀購自日本島津公司和美國ABscix公司。

1.2 海參多糖含量測定

1.2.1 海參多糖制備

參照SC/T 3049—2015[9]方法制備海參多糖：新鮮與速發海參，剪成0.5 cm ×0.5 cm的小塊，70 ℃烘干12 h，粉碎，過10目篩，混勻備用。準確稱取各樣品的海參干粉0.1 g，置于錐形瓶中，加入12.5 mL的含有5 mmol/L EDTA溶液和5 mmol/L半胱氨酸的0.1 mol/L乙酸鈉緩沖溶液(pH 6.0)和10 mg木瓜蛋白酶，于60 ℃恒溫水浴下攪拌，酶解反應24 h。然后，將反應后的混合物在8 500 rpm/min、20 ℃條件下離心10 min，取上清，加3.10 g乙酸鉀，超聲振蕩混合均勻，于4 ℃靜置12 h。最后，離心(8 000×g，10 min，20 ℃)取沉淀，定容于10 mL容量瓶中，即得海參多糖溶液。

1.2.2 酸水解

取0.5 mL海參多糖溶液于水解管中，加入0.5 mL 4 mol/L的三氟乙酸，密封，在110 ℃條件下水解3 h。冷卻后減壓除去溶劑，再加入0.5 mL甲醇，減壓除去溶劑，重復以上步驟3次，達到去除三氟乙酸的目的。配制0.02、0.04、0.06、0.08、0.10和0.20 mg/mL的巖藻糖標準溶液按以上步驟水解。

1.2.3 PMP衍生化

水解產物用400 μL的氨水溶解，再加入400 μL 0.3 mol/L的PMP甲醇溶液和100 μL 0.5 mg/mL的乳糖內標溶液，密封，70 ℃水浴30 min。冷卻后減壓除去溶劑，再加入1 mL甲醇，減壓除去溶劑，重復以上步驟3次。然后加入1%的乙酸水溶液，再加入1 mL的氯仿，振蕩后除去氯仿，重復萃取3次，水層作為供試液。供試液經0.22 μm微孔濾膜過濾后，進行HPLC-MS/MS液質分析。

1.2.4 HPLC-MS/MS條件

色譜條件：采用Thermo Scientific Hypersil Gold(150.0 mm× 2.1 mm，5 μm)色譜柱。柱溫30 ℃，流動相為20 mmol/L乙酸銨-乙腈(88∶12，V/V)，體積流量0.5 mL/min。

質譜條件：離子源ESI+源，噴霧電壓5.5 kV，輔助加熱氣溫度600 ℃，氮氣作為碰撞氣和噴霧氣，多重反應監測(MRM)模式。其它質譜分析參數見表1[8]。

表1 巖藻糖和乳糖的PMP衍生物的質譜分析條件Tab.1 Parameters for MRM analysis of PMP-labeled fucose and lactose

1.3 海參多糖含量計算

1.3.1 巖藻糖標準工作曲線建立

以巖藻糖與乳糖標準工作液濃度比為橫坐標x，以其峰面積比為縱坐標y，繪制標準工作曲線。在本實驗條件下，配制質量濃度為0.02～0.20 mg/mL范圍的系列標準液，最終得到的標準曲線方程如下：y=1.579 9x-0.103 1，(R2=0.996)。將得到的峰面積帶入標準曲線方程中，可得出供試樣品中巖藻糖的濃度，由此濃度轉化為海參多糖的濃度。

1.3.2 海參多糖含量計算

海參多糖含量按照SC/T 3049—2015[9]中的公式計算，根據海參樣品中巖藻糖的含量和巖藻糖在海參多糖中的比例，將巖藻糖的含量乘比例系數(20)，即可計算出海參多糖的含量。

1.4 數據分析

所有實驗重復3次，數據表示為(平均值±標準差)。利用SPSS 19軟件對數據進行單因子方差分析，檢驗方差齊性，對不同數據進行Duncan多重比較，P<0.05表示數據差異顯著。采用Pearson進行相關性分析。利用Excel和Origin 8.5作圖。

2 結果與討論

2.1 養殖地對海參多糖含量的影響

本研究首先分析了采集自4個養殖地的同一批次海參中多糖含量的差異，結果如圖1A～圖1D所示，所有批次中，2#養殖地的海參中多糖的含量都高于其他3個產地，含量為(94.36±15.71) mg/g(P<0.05)，其次是4#養殖地的海參，為(70.24±8.12) mg/g。整合每個養殖地4個批次海參多糖含量數據，結果如圖1E，也顯示2#養殖地的海參中多糖含量最高，其次為4#養殖地。以上結果表明，養殖地對海參中多糖的含量有明顯影響，相較之下2#養殖地海參多糖含量最高。

已有研究表明，養殖方式對海參的生長、存活率、感官、加工性能以及營養成分都有顯著的影響[10-11]。圈養海參蛋白、粗脂肪含量均高于底播養殖海參，而微量元素如硼、鉻和銅元素含量均低于底播養殖海參[12]，但圈養海參常量元素含量卻高于底播養殖海參[10]。本研究中，1#和2#為圈養養殖，3#和4#為底播養殖，兩組間未呈現明顯差異，不能說明養殖方式對海參多糖含量有顯著影響。綜上所述，不同養殖地的生鮮海參中多糖含量差異較大，但原因還有待進一步揭示。

2.2 速發海參多糖含量

表2 速發海參多糖含量Tab.2 Polysaccharide contents of Sufa sea cucumbers

將2.1部分的16份生鮮海參分別加工為速發海參后，檢測它們的多糖含量。如表2所示，速發海參多糖含量在70.9～178.4 mg/g之間波動，其中1# 養殖地的第4批次海參制成的速發海參多糖含量相對較低，而4# 養殖地的第2批次的含量相對較高。速發海參相對于生鮮海參原料，多糖含量增加，這可能是因為海參本身含有16%(以干海參計)的鹽分[13]，在速發海參產品加工過程中鹽分被除去使多糖含量相對提高。

為了考察海參原料中多糖的含量與其制成的速發海參制品多糖含量間的關系，本研究對16批次生鮮海參與其制成的速發海參中的多糖含量的進行了相關性分析。由圖2可知，生鮮海參多糖含量與其制成速發海參的多糖含量不存在顯著相關性(r=0.16，P>0.05)。該研究結果說明，海參原料并不能顯著決定其制成的速發海參產品中的多糖含量，產品的加工過程對速發海參產品的多糖含量有重要影響。

2.3 海參多糖含量數據的積累與分析

限制海參多糖的含量范圍對提升海參的產品標準有重要意義。為了確定海參多糖的含量范圍，本研究進一步檢測了刺參主要養殖區(大連、煙臺及威海等)46個養殖地的生鮮海參樣本中的多糖含量，并整合前文2.1部分的16份生鮮海參多糖數據，共積累了62份生鮮海參多糖含量數據進行分析。結果如圖3所示，62份樣本中，生鮮海參中多糖含量最低為39.4 mg/g，最高為164.5 mg/g，差異非常大。將這些海參樣本根據養殖方式分為底播養殖(n=34)和圈養養殖(n=28)兩組，分析后發現，不同養殖方式的海參多糖含量不具有顯著差異(P>0.05)。進一步分析海參多糖的含量分布，發現海參多糖含量主要集中在62～108 mg/g，如圖4所示。目前對海參多糖含量數據報道非常有限，本研究結果可為海參多糖含量標準的設定提供數據參考。

3 結論

本研究通過對不同養殖地的海參及其速發海參產品中多糖含量的分析發現，養殖地對海參多糖含量有顯著影響(P<0.05)；速發海參多糖含量范圍為70.9～178.4 mg/g，速發海參多糖含量高于生鮮海參，但與作為其原料的生鮮海參多糖含量不存在顯著相關性(r=0.16，P>0.05)；本研究匯總了62個生鮮海參樣本數據進行分析，發現生鮮海參多糖含量范圍為39.4～164.5 mg/g，主要集中在62 ～108 mg/g；養殖方式對海參多糖含量沒有顯著影響(P>0.05)。本研究結果揭示了養殖地、養殖方式對海參多糖含量的影響，可為海參產品標準中多糖含量的設定提供參考。