基于UPLC-QTOF/MS法快速靶向篩查與測定克氏原螯蝦中的三環唑

陳建武，彭婕，甘金華，楊總，張濤，何力*

(1.農業農村部淡水魚類種質監督檢驗測試中心， 農業農村部水產品質量安全風險評估實驗室(武漢)，中國水產科學研究院長江水產研究所， 湖北 武漢 430223; 2.上海愛博才思分析儀器貿易有限公司， 上海 200335)

克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)的稻蝦輪作因綠色養殖、環境友好的新型養殖模式，可實現種養共生互利，增產增收的優勢而被廣泛推廣。但同時，稻田以及蝦塘周邊農作物耕種過程中因所施用農藥對稻田養蝦的食用安全性而備受關注。在農作物生產中施用的除草劑、殺菌劑和殺蟲劑等污染物存在由周圍環境經排放灌溉、雨水徑流等方式進入養殖水體等的現象，因其具有復雜和不確定性，給水產品食用安全性帶來風險，已成為稻蝦養殖模式下水產品質量安全的一大隱患和關注焦點[1-5]。有研究報道，多種農藥極易通過雨水徑流等方式流入水生系統中，在農作物周邊水生態系統中常有檢出[1-2，6-7]。

三環唑(tricycalzole)為中等毒性的內吸性三唑類殺菌劑，主要用于水稻稻瘟病防治，在水稻種植中被廣泛應用[8-10]。三環唑屬于低毒性的農用殺菌劑。有研究報道，三環唑對水生生態系統具有潛在的風險[6-7，11]，人體中毒后也會引起不同程度的不適癥狀[12]。三環唑在中國水產品中沒有相關限量的要求[13]，在水產品的殘留研究也少有報告[4]。目前，對三環唑的殘留檢測研究大都集中在農作物及其耕作土壤中，多采用高效液相色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜串聯質譜法和氣相色譜串聯質譜法等檢測方法[8-10，12-16]檢測。近年來也有用超高效液相串聯四級桿飛行時間質譜法或氣相色譜串聯四級桿飛行時間質譜法非靶向篩查糧谷中的農藥殘留，并檢測到三環唑[3，17-19]的報道?？耸显r中三環唑的篩查與檢測方法尚未見報道，僅有通過靜電場軌道阱高分辨質譜對水產品中農藥殘留的篩查[4]和通過高效液相色譜串聯質譜對克氏原螯蝦中的二甲戊靈殘留的檢測方法的研究報道[5]。以四級桿飛行時間質譜為代表的高分辨質譜分析檢測技術具有較寬的掃描范圍，較高的特異性、高質量準確度和高分辨率等優勢被廣泛應用于食品安全檢測領域中的對農獸藥殘留的靶向和非靶向定性定量分析[3，4，17-27]。本研究采用超高效液相串聯四極桿飛行時間質譜對克氏原螯蝦肌肉中三環唑的殘留進行靶向快速篩查，并借鑒有關文獻方法，采用溶劑提取、QuEChERS前處理方法進行了定量分析，以期為檢測克氏原螯蝦中的三環唑殘留提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

美國Agilent UPLC 1290串聯QTOF 5600+(美國SCIEX公司)(配有MultiQuant3.0.2和MasterView?2.2數據采集分析軟件)；分析天平(梅特勒-托利多 PL202-L)；超聲波清洗機(上?？茖K5210LHC)；旋蒸儀(鞏義市予華儀器RE-2000E)；渦旋振蕩儀(SCILOG MX-F)；離心機(Sigma 3K15)。

三環唑標準品(純度為99.6%，DR公司)；甲醇、乙腈及甲酸(均為JT Baker公司，色譜級)；無水硫酸鎂和氯化鈉(國藥集團，分析純)。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備

克氏原鰲蝦剝殼去頭、內臟并拔掉腸腺后，取肌肉部分處理成小于0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的小塊，混勻，用高速絞肉機充分攪散均勻，用密封袋封好，標記并于-18 ℃冷凍備存。

1.2.2 提取

1.2.2.1 靶向篩查分析前處理

參照文獻[4，22]進行前處理方法優化，并稍作修改。本篩查方法步驟如下：稱取5 g(±0.01 g)肌肉于50 mL具塞離心管中，25 mL乙腈(含0.1%甲酸，V/V)提取，渦旋2 min，超聲5 min，6 000 r/min離心5 min，重復上述步驟提取一次，合并上清液轉移至125 mL雞心瓶中，40 ℃減壓旋蒸至近干，用1 mL的50%甲醇(含 0.1%甲酸)振蕩超聲溶解，過0.22 μm有機濾膜上機。

1.2.2.2 定量分析前處理

參照文獻[4，14-17，22-23]，優化了樣品前處理方法：稱取2.00 g(±0.01 g)肌肉于50 mL具塞離心管中，加入25 mL乙腈(0.1%甲酸)后渦旋振蕩1 min后，加入3 g無水硫酸鎂、2 g氯化鈉，渦旋2 min，超聲5 min，6 000 rpm離心后，上清液轉移至雞心瓶，乙腈重復提取一次，合并上清液，40 ℃減壓旋蒸至近干，用乙腈-水(1∶1,V/V)1 mL 復溶，轉移至1.5 mL離心管中，加入20 mg的石墨碳化黑(GCB)和50 mg的酸性氧化鋁(AL-A)后，渦旋混勻后超速離心，取上清液過0.22 μm有機濾膜上機。

1.2.3 標準溶液配制

準確稱取適量的三環唑標準品，用甲醇配成100 mg/L的標準儲備液，于-18 ℃冰箱中避光保存；用甲醇-水(1∶1,V/V)稀釋標準儲備液，分別配制成質量濃度為1 μg/mL、0.5 μg/mL的標準中間溶液，于-18 ℃避光保存。根據需要，吸取一定量的標準中間溶液，用水稀釋成質量濃度為0.5、2.0、10.0、20.0、50.0和100.0 ng/mL的系列標準工作液。根據需要，采用前文1.2.2.2節前處理方法處理空白克氏原螯蝦樣品，制備得到空白樣品溶液，用空白樣品溶液稀釋三環唑標準中間液，分別配制質量濃度為0.5、2.0、10.0、20.0、50.0和100.0 ng/mL的系列空白基質匹配標準溶液。

1.2.4 色譜條件

色譜柱：Waters BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，柱溫30 ℃，流速為0.3 mL/min，流動相A為0.1%甲酸(V/V)， B為甲醇。靶向篩查梯度洗脫程序：0～2 min，95% A；2～20 min，90%～5%A；20～28 min，5%A；28.1～35.0 min，90%A；進樣量為20 μL。定量分析梯度洗脫程序：0～0.5 min，95% A；0.5～2 min，95%～85%A；2～5 min，85%～5%A；5～7 min，5%A；7.1～10 min，95%A；進樣量為10 μL。

1.2.4 質譜條件

靶向篩查質譜條件：DuoSprayTM離子源，電噴霧電離(ESI)，正離子模式掃描，離子源溫度為550 ℃；噴霧電壓為5 500 V，去簇電壓(DP)為80 V；霧化氣(GS1)為45 psi；輔助霧化氣(GS2)為45 psi；氣簾氣(CUR)為30 psi。積累時間為0.25 s，信息依賴性掃描(IDA)模式；IDA觸發15個子離子掃描；碰撞電壓為(35±15)eV，TOF MS進行全掃描，TOF MS /MS進行二級子離子掃描。

定量分析質譜條件：DuoSprayTM離子源，電噴霧電離(ESI)，正離子模式掃描，離子源溫度為550 ℃；噴霧電壓為5 500 V； GS1為45 psi； GS2為45 psi； CUR為30 psi；積累時間為0.25 s，采用MRMHR掃描，根據靶向篩查和質譜優化結果選擇高靈敏模式來監測三環唑特征峰(190.0/ 136.0*，190.0/163.0，*為定量離子)，去簇電壓為89 V，碰撞能為32 eV。

1.2.5 三環唑本地標準庫建立及靶向篩查方法

將質量濃度為0.5 μg/mL的三環唑標準中間溶液經色譜柱分離后，在飛行時間質譜中進行全掃描(范圍為100～1 000 Da)，并進行一定碰撞能范圍內(±15 eV)的一級、二級離子碎片掃描，得到[M+H]+準分子離子和碎片離子的精確分子量，結合文獻以及一級、二級圖譜中的TIC圖，在IDA圖譜中找到碎片的精確分子量，色譜保留時間，同時將化合物名稱、結構式、分子式和美國化學文摘登記號(CAS)等信息導入譜圖文庫，建立三環唑標準圖譜，并用CSV格式輸出保存，建立三環唑目標物靶向快速篩查的標準庫。

儀器篩查方法的檢索參數包括精確質量數偏差小于5 ppm(5.0×10-6)，信噪比小于3，峰響應閾值強度為2.0×103，同位素比值偏差小于20%，將前文1.2.2.1前處理樣品采集信息和本地標準圖譜庫比較，設置靶向篩查權重因子(質量偏差因子0.3，同位素比值偏差因子為0.3，庫匹配因子為0.4)，綜合得分大于80，并通過二級碎片譜圖匹配比對排除假陽性，視為確證三環唑陽性樣品。

2 結果與討論

2.1 三環唑標準庫圖譜及靶向篩查方法建立

藥物靶向快速篩查主要基于QTOF的高分辨數據庫，該數據庫儲存了化合物多方位譜圖信息并進行了歸類，但不同的儀器產生的化合物信息及響應均有所差異，因此需要建立本地標準庫，圖1為本地標準品庫中三環唑的提取離子流色譜圖。將三環唑化合物名稱、結構式、分子式、精確分子量、CAS號及碎片離子精確質量數等所有相關信息導入本地專屬三環唑數據庫，并存儲三環唑二級碎片離子譜圖信息，結合MasterView定性篩查分析軟件，用于和克氏原螯蝦基質樣品的一級、二級譜圖相似度匹配。導入三環唑本地標準(后綴名.csv)，為降低檢索數據量和復雜程度，加快匹配速度并提高準確性，按前文1.2.5中所述方法設置目標物檢索參數，對目標物進行靶向快速確證。圖2為克氏原螯蝦基質添加三環唑標準溶液后的提取離子流圖和一級、二級譜圖對比圖。

靶向篩查基于高分辨數據庫，該庫存儲了專屬化合物多方位信息。通過高分辨數據庫結合化合物信息篩查對比確證功能的MasterView軟件分析，利用專屬庫以及Library中存儲的一定碰撞能下的二級質譜圖，用于一級、二級譜圖相似度鏡像比對(圖2)，能提供更有利的匹配條件，減少假陽性。通過前述檢索參數設置，提高了篩查速度和篩查結果的準確性。經過對比，最終實際分析中的精確質量數偏差為2 ppm，與標準品保留時間差小于0.5min，MasterView軟件計算綜合得分在90.9左右，與標準品的二級碎片離子圖譜質匹配比對通過，因此，確證通過，可進行下一步的定量分析。

2.2 定量分析方法

在建立三環唑本地譜圖庫后并與陽性樣品篩查匹配時(圖2)，發現三環唑有3個響應值較高的子離子，分別為(m/z)163.0，(m/z)136.0，(m/z)109.0，其中(m/z)136.0響應值最高，且相對特異性較高，因此選擇(m/z)136.0作為定量離子，次高的為定性離子(m/z163.0)。

QTOF的靶向掃描模式可以通過質譜優化和高分辨率下MRM方法實現對農藥污染物的定量檢測。雖然缺乏凈化步驟的前處理可以避免化合物漏檢，但對于準確定量測定，需解決水產品基質干擾嚴重，檢測靈敏度較低的問題[4，28]?？耸显r肌肉中含有大量的蛋白質和脂肪，基質復雜，直接提取的回收率不理想，背景噪音也較高[4，28]，因此需要在提取后進行凈化處理由于乙腈對三環唑具有良好的溶解性，且能沉淀部分蛋白質，因此直接采用乙腈進行提取，可避免漏檢三環唑[4]。參考相關文獻，按前文1.2.2.2前處理所述方法，本實驗酸化乙腈提取之后，依次采用無水硫酸鎂除水，飽和氯化鈉鹽析去除蛋白質，石墨碳化黑和酸性氧化鋁去除克氏原螯蝦肌肉中色素和脂肪后，采用MRMHM模式對克氏原螯蝦肌肉中的三環唑中進行定量分析。將空白基質匹配的體積濃度分別為0.5、2.0、10.0、20.0、50.0和100.0 μg/L 三環唑標準溶液，以MRMHM監測(190.0/136.0)定量離子的峰面積為橫坐標，溶液濃度為縱坐標，采用MultiQuant 3.0.2軟件繪制標準曲線回歸方程：Y=694.34X+ 29.16，r=0.999 5。以3倍信噪比時的檢測含量為檢出限(LOD)，結果為0.5 μg/kg，定量限(LOQ)為1.0 μg/kg。上述結果表明QuEChERS方法能快速凈化和除脂，線性相關良好，檢測限較低，能滿足檢測要求。

2.3 基質效應

在優化的質譜參數下，按1.2.3所述，用三環唑標準儲備液配置克氏原螯蝦的系列空白基質匹配標準溶液，繪制標準曲線。采用基質匹配標準曲線和溶劑標準曲線的斜率之比(M)評價基質效應[10]，比值越接近1，說明基質效應越小。結果表明，三環唑在克氏原螯蝦肌肉中的基質效應(M)為0.34，存在較強的基質效應，最終采用空白基質匹配標準曲線進行定量。

2.4 回收率和精密度

以不含三環唑的空白克氏原螯蝦肌肉為基質，采用基質加標法評價回收率和精密度。添加水平分別為0.5、10.0和20.0 μg/kg，每個水平重復6次。結果發現3個添加水平的回收率為65.15%～94.24%，相對標準偏差為5.31%～8.12%，其回收率和精密度均滿足克氏原螯蝦中三環唑殘留檢測要求。圖3為空白基質添加水平為10.0 μg/kg的三環唑MRM色譜圖。

2.5 實際樣品測定

采用建立的快速靶向篩查方法對實驗室2018年采集自稻田養魚塘的重點水產品中的79個克氏原螯蝦樣品中的三環唑進行快速靶向篩查，對克氏原螯蝦樣品按前文1.2.2.1經通用前處理后，與三環唑標準品的高分辨二級碎片譜圖數據庫進行匹配，其質量數偏差小于5 ppm，譜圖匹配度綜合得分在80～100之間，通過二級碎片譜圖比對后排除假陽性后，即可定性通過為陽性樣品。同時克氏原螯蝦樣品按照前文1.2.2.2經提取、凈化后，采用定量分析方法測定，結果均沒有三環唑檢出。郭思言等[4]對水產批發和零售市場上的水產樣品進行了分析，發現樣品中三環唑的檢出率為1.2%，但檢測對象沒有涉及克氏原螯蝦。本實驗檢測的克氏原螯蝦樣品均抽檢自水質良好的稻田養蝦塘，稻田養蝦采取的是“蝦稻共生”的綠色生態種養模式，即在一季稻田里養殖小龍蝦，蝦為稻“除草、松土、增肥”，稻為蝦“供餌、遮陰、避害”。因此，三環唑的施撒行為可能性很少，實驗室采樣過程中調查采訪抽樣對象得知種稻養蝦過程中沒有使用三環唑，所以該年度所抽檢的克氏原螯蝦樣品沒有檢測出三環唑。

3 結論

高分辨飛行時間質譜儀對陽性樣品的定向篩查較為準確和快速，而經過定量方法優化后UPLC-QTOF-MS/MS對一些農藥污染物的定量分析能力并不遜色于液相色譜串聯三重四級桿質譜儀，遠高于液相檢測方法。本研究建立的基于UPLC-QTOF/MS法快速靶向篩查與測定克氏原螯蝦中的三環唑方法，通過自建的本地專屬三環唑標準數據庫和Library庫，結合MasterView篩查軟件對克氏原螯蝦中的三環唑進行靶向快速篩查分析并確證，并在此基礎上采用QuEChERS方法對三環唑進行定量，并對稻田養蝦塘中的克氏原螯蝦抽檢樣品進行了測定。本方法篩查快速準確，定量檢測的LOD、LOQ及回收率均能滿足三環唑的檢測要求，因此可用于克氏原螯蝦可食肌肉中三環唑的快速靶向篩查和定量分析，同時也可為水產品中農藥殘留的快速篩查和定量檢測提供參考。