刺五加、板藍根中殘留有機氯農藥提取條件優化

韓藝凡，繆文麗，張慧慧，冷運儒，郎 朗

(哈爾濱商業大學 英才學院，哈爾濱 150076)

刺五加和板藍根藥用的由來已久，是中國傳統中藥.刺五加味辛、微苦、性溫，具有益氣健脾、補腎安神的功效[1]，適用于腎肺兩虛、心脾不足、失眠多夢等癥[2]，近代臨床研究表明，刺五加中含有多種活性化學成分，具有抗衰老，抗癌，降血糖等作用[3-6]，目前廣泛用于治療風濕病、冠心病、心絞痛和腦梗死等[7].板藍根性味苦寒，具有清熱解毒、涼血、利咽的功效[8]，適用于溫熱發病，癰腫瘡毒等[9]，在臨床上常被用于治療流感、扁桃體炎、毛細支氣管炎、防治流行性乙型腦炎等[10-12]，板藍根顆粒能有效預防流行性感冒發熱，為家庭常備藥[13].有機氯農藥的危害極大，可影響男性生育功能，有致畸和潛在的致癌威脅[14]，藥材中有機氯農藥的殘留不僅會影響藥材質量，食用后還會堆積于脂肪組織，損傷機體，危害人類健康[15].因此建立能夠準確測定有機氯農藥殘留的方法變得極為重要.本試驗以刺五加、板藍根為實驗材料，對影響超聲提取法提取效率的3個因素(提取溫度、提取時間、丙酮-二氯甲烷組成比例)進行正交試驗，并結合氣相色譜法進行殘留農藥的含量測定，選出最優提取條件，為合理安全使用中藥材提供科學依據.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

刺五加：遼寧省朝陽市某中草藥種植產業協會；

板藍根：吉林撫松縣某大型中藥材種植基地.

濃硫酸(優級純)、正己烷(分析純)、丙酮(分析純)、二氯甲烷(分析純)、無水硫酸鈉(分析純)、氯化鈉(分析純)、正己烷(色譜純)試劑均為國產.

標準品與供試樣品：六氯苯(HCBs)、γ-六六六(γ-HCH)、七氯(Heptachlor)、反式氯丹(Trans-chlordane)(質量濃度20 μg/mL)、p, p′-DDT(質量濃度100 μg/mL)、艾氏劑(Aldrin)均購自國家標準物質研究中心.

1.2 儀器

美國Agilent公司生產的MSD 質譜檢測器和6890N氣相色譜儀(ECD檢測器)；鄭州長城科工貿有限公司生產的SHB-Ⅲ型循環水真空泵；上海一恒科技有限公司生產的DZF-6030A型真空干燥箱；深圳市潔盟清洗設備有限公司生產的JP-030ST型超聲波清洗機；

1.3 色譜條件

選用規格為HP-5 (30 m×0.25 mm×0.25 μm)的Agilent彈性石英毛細管柱，進樣口溫度為290 ℃；檢測器的溫度300 ℃；進樣量為1.0 μL；色譜柱進行程序升溫：開始溫度為100 ℃，恒溫1 min，先以10 ℃/min的升溫速率加熱至200 ℃，恒溫2 min，再以8 ℃/min的升溫速率加熱至280 ℃，恒溫2 min；采取不分流進樣方式，將N2(>99.999%)作為載氣：1.5 mL/min(恒流)，外標法定量.電子電離源；電離能量為70 eV；發射電流為0.2 mA；光電倍增器的電壓350 V；離子源的加熱溫度為200 ℃；氣相色譜接口溫度為285 ℃；掃描質量范圍為50～450 amu；掃描速度為1 s/scan；溶劑延遲時間為4 min.

1.4 試驗方法

1.4.1 提取方法

準確稱取2.0 g樣品藥材與10 g無水硫酸鈉于250 mL具塞錐形瓶內混勻，呈松散狀.加入30 mL一定比例的丙酮-二氯甲烷(2+1、1+1、1+2)浸泡12 h，超聲提取一定時間(15、20、25 min).靜置5 min，過濾，適用旋蒸瓶直接收集濾液，所剩殘渣再分別加入30 mL丙酮，重復超聲提取3次，并合濾液.將提取液于一定溫度(20、30、40 ℃)水浴上減壓濃縮，加5 mL正己烷，操作如上，反復幾次至溶液近干，即可除凈二氯甲烷和丙酮.將所得溶液轉移到離心管中，正己烷定容至5 mL.緩慢加入1 mL濃硫酸，振蕩搖動約1 min，離心(3 000 r·min-1) 10 min.取上清液，即得.

1.4.2 有機氯農藥殘留量測定方法

1) 標準品溶液制備

用正己烷分別將六氯苯、γ-六六六、七氯、艾氏劑、p, p′-DDT、反式氯丹6種農藥標準品制成質量濃度為10 μg/mL的標準品儲備液.精密量取1 mL標準品儲備液定容至10 mL容量瓶中，得到質量濃度均為1 μg/mL的混合標準品儲備液.

2) 建立標準曲線

將質量濃度為1 μg/mL的標準品儲備液，分別用正己 烷稀釋成5個不同的質量濃度，其中六氯苯、七氯、反式氯丹、p, p′-DDT分別配制成質量濃度為5、50、100、200、1 000 μg/L標準品溶液；γ-六六六、艾氏劑分別配制成質量濃度為5、50、100、200、250 μg/L標準品溶液.按照“1.3”的條件進樣，平行3次試驗，進行線性回歸，利用Excel制作標準曲線，計算回歸方程.

3) 有機氯農藥殘留量的測量

取3份供試品藥材，按“1.4.1”制備供試品，按“1.3”進樣，進行GC分析，得到相應的峰面積，根據回歸方程計算供試樣品藥材中殘留的含有機氯農藥量.

1.4.3 正交試驗優化

選取提取溫度、提取時間、丙酮-二氯甲烷組成比例3個因素作為考察對象分別為A、B、C.如表1所示，選擇3個水平設計正交試驗，選用L9(34)正交表，把其中一列視為空白列，對比實驗結果篩選出最優提取條件.

表1 刺五加、板藍根中有機氯正交設計因素水平表

2 試驗結果與討論

2.1 有機氯農藥的標準曲線

6種有機氯農藥均具有良好的線性關系，相關數據見表2.在測定刺五加和板藍根中殘留的含有機氯農藥量時，只需將通過色譜法得到的峰面積值代入對應有機氯農藥的回歸方程，即可計算出相應含農藥殘留量.

表2 有機氯農藥的回歸方程、相關系數及線性范圍

2.2 正交試驗結果

刺五加中檢測出p, p′-DDT、六氯苯和七氯三種有機氯農藥殘留，表3為三種農藥的正交試驗結果，表4為結果分析，表5為方差分析.板藍根中檢測出p, p′-DDT和七氯兩種有機氯農藥殘留，結果見表6～8.表6為兩種農藥的正交試驗結果，表7為結果分析，表8為方差分析.由正交試驗結果可知，提取溫度、提取時間和丙酮-二氯甲烷組成比例對刺五加、板藍根中殘留有機氯農藥的提取效果影響趨勢相同.由方差分析可知，提取溫度和提取時間對刺五加、板藍根中殘留有機氯農藥的提取均具有顯著影響，而溶劑比例對農藥的提取無顯著影響，確定其影響因素的大小是：A>B>C，即提取溫度(℃)>提取時間(min)>丙酮-二氯甲烷組成比例.由表3、4和表6、7可知刺五加、板藍根中有機氯農藥提取的最優方案均為A3B3C3，即最優提取條件為：提取溫度40 ℃、提取時間25 min、丙酮-二氯甲烷(1+2)作提取溶劑.

表3 刺五加中有機氯試驗方案及試驗結果

表4 刺五加中有機氯試驗結果分析

表5 刺五加中有機氯方差分析

表6 板藍根中有機氯試驗方案及試驗結果

表7 板藍根中有機氯試驗結果分析

含p.p'-DDT量/(μg·kg-1)K184.38101.00125.76135.22K2111.51135.70125.27113.88K3186.03145.22130.89132.82k128.1333.6741.9245.07k237.1745.2341.7637.96k362.0148.4143.6344.27極差R33.8814.741.877.11因素主次ABC優方案A3B3C3

表8 板藍根中有機氯方差分析

3 結 語

本文通過方差分析確定三因素的影響大小為順序為: 提取溫度(℃)>提取時間(min)>丙酮-二氯甲烷組成比例.實驗結果表明刺五加、板藍根中殘留有機氯農藥的最優提取條件為：A3B3C3，即在40 ℃下用30mL的丙酮-二氯甲烷(1+2)超聲提取25 min.