三疣梭子蟹體內As 的蓄積特異性研究*

韓雅荃 陳碧鵑 張 艷① 夏 斌 唐學璽

(1. 中國海洋大學海洋生命學院 青島 266003；2. 中國水產科學研究院黃海水產研究所農業農村部海洋漁業可持續發展重點實驗室 青島 266071)

中國是世界上唯一一個水產養殖產量超過捕撈產量的國家，水產養殖總產量約占世界水產養殖總產量的70% (陳雨生等, 2012)。水產養殖產業不僅是我國主要的食物來源之一，也是農產品出口貿易的重要組成部分。

隨著沿海工業化的發展，海洋重金屬污染已成為十分突出的環境問題。已有研究表明，在渤海中部、山東半島南部近海、深圳灣海域、珠江口海域、江蘇近海、廣西廉州灣、南海等近海海水中諸多重金屬離子如銅(Cu2+)、鉛(Pb2+)、砷(As3+, As5+)、汞(Hg2+)和鎘(Cd2+)的濃度逐年升高，已經超過第一類海水水質標準(徐勇等, 2017; 李月等, 2010; 彭鵬飛等, 2017;時運紅等, 2017; 顧莉等, 2012; 崔振昂, 2018; 王璐等, 2017)。雖然，大部分水體中重金屬濃度均控制在輕度或無污染程度，但是由于Cu、Pb 和As 等重金屬具有較高的富集因子(孫玲玲等, 2018)，會在生物體內慢慢蓄積并沿食物鏈逐級放大，這不僅對水產養殖動物的生長和繁殖造成直接影響，食用這些受污染的生物會嚴重威脅人類的健康(Rastegar et al, 2014;Ekino et al, 2007; Mukherjee et al, 2006; Nawrot et al,2010)。

As 是一種具有類似于重金屬元素毒性的非金屬元素，以有機砷(Org-As)和無機砷(In-As)的形式廣泛存在于自然界中(Braman et al, 1973)。本研究中，所提到總砷即為這二者的總和。通常來說，無機砷比有機砷具有更高的生物毒性。其中，無機砷主要以亞砷酸鹽(As3+)和砷酸鹽(As5+)形式存在，而As3+的毒性更高，為As5+的11 倍(趙鳳, 2012; 陳麗竹等, 2017)。有機砷的種類相對無機砷要復雜得多，主要以甲基砷(Monomethylarsonate, MMA) 、 二 甲 基 砷 酸(Dimethylarsinate, DMA)、三甲基砷(Trimethylarsine,TMA)、砷–谷胱甘肽等形式存在(杜森等, 2019)。生物體會將一部分的無機砷通過生成甲基化砷和砷–谷胱甘肽等毒性較低的有機化合物來降低砷的毒害(趙鳳,2012)，此外，As 被生物體吸收后易在體內蓄積，長期過量會對生物體造成嚴重危害(Grund et al, 1987;Casarett et al, 2001; 劉靜等, 2018)。美國疾病控制中心(Centers for Disease Control and Prevention，CDC)和國際癌癥研究機構(International Agency for Research on Cancer，LARC)將As 確定為第一類致癌物質(趙素蓮等, 2002)。諸多研究表明，在青梭子蟹(Portunus segnis)、截形斧蛤(Donax trunculus)、紅鯔魚(Mullus barbatus)等海產品中都檢測出不同程度的As (Ghaeni et al, 2015; Ferrante et al, 2019; Copat et al, 2018;Filippini et al, 2018)，而這些含As 的海產品是人類攝入As 的主要途徑之一(Jia et al, 2018)。

蝦、蟹等甲殼類水產生物是人們所喜愛的食品，同時，也是As 富集因子較高的水產生物之一(程家麗等, 2017; 蔣玉艷等, 2017; 胡立成等, 2017)。雖然國內外學者對甲殼類重金屬污染特征和蓄積特異性進行了大量的研究(Hosseini et al, 2014; Ip et al, 2005;Protasowicki et al, 2008; Flores et al, 2014)，但目前大部分研究集中于As 在甲殼類體內的生物富集情況進行了研究(Ghaeni et al, 2015; Bakker et al, 2017; Liu et al, 2017)，結果發現，各個器官中，污染物濃度在肝胰腺中最高，肌肉中最低。而關于甲殼類總砷的蓄積特異性研究則尚未見報道。

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)具有經濟價值高、生長快、繁殖技術成熟等特點，是我國北部產量最高的海產食用蟹類之一(戴愛云等, 1997)。關于三疣梭子蟹As 的蓄積特異性研究尚未報道。本研究通過分析三疣梭子蟹不同組織中總砷的含量，運用雙箱動力學模型研究三疣梭子體內As 的富集動力學過程，闡明三疣梭子蟹中As 的蓄積特異性，以期為未來的防控技術提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗生物

實驗選用規格相近、活力旺盛的健康三疣梭子蟹240 只，平均殼長為(70.32±2.46) mm，平均殼寬為(140.23±2.66) mm，平均體重為(139.86±5.22) g，于2018 年9 月購自山東日照市某養殖場，該海域As 的環境背景值為0.91 μg/L。

1.2 試劑與儀器

實驗用硫脲、NaOH、硼氫化鉀均為上海國藥試劑廠的分析純試劑；實驗所用As 的標準溶液為中國計量科學研究院1000 mg/ml 五價砷的標準溶液；分析用水為Millipore-F2BN 43517C 型超純水裝置制備的超純水；所用水箱為聚乙烯塑料水箱(規格為106 cm×64 cm×20 cm)。實驗所有玻璃器皿均以硝酸溶液(1+4)浸泡24 h，用自來水反復沖洗后，再用去離子水沖洗3 遍。消化儀器為X42A 鋁模塊自動消化裝置，分析儀器為AFS-933 原子熒光光度計。

1.3 實驗方法

1.3.1 三疣梭子蟹的暫養 將三疣梭子蟹暫養于聚乙烯塑料水箱中。暫養期間，連續充氧，每天于18∶00 投喂1 次(投喂量為三疣梭子蟹體重的10%，根據餌料食用情況增減)。投喂2 h 后，完全換水1 次，所用海水鹽度為30.4～30.7，水溫為22℃～25℃，pH 為8.0～8.3，溶解氧(DO)＞6.5 mg/L。

1.3.2 暴露實驗 實驗分為富集和釋放2 個階段，均進行15 d。實驗暴露濃度以漁業水質標準為中間值，選擇低于5 倍和高于10 倍，同時，又根據實際情況進行調整，最終將實驗濃度梯度設為4 組，其中，3 組為實驗組，1 組為海水對照組，每組設3 個平行。實驗組的暴露濃度分別為5、20、100 μg/L。

富集過程采用半靜態法進行暴露實驗。充氧，使海水中DO＞6.5 mg/L，每 24 h 換水1 次，換水量為100%。實驗開始加As 前，采集三疣梭子蟹樣品，以測量總砷的本底值。定期查看三疣梭子蟹健康狀況，及時將行為異?；蛘咚劳龅娜嗨笞有窊瞥?。實驗期間，三疣梭子蟹餌料為鮮活飼料[菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum)]，投喂情況與暫養期間一致。分別于第0、3、5、10、15 天采集三疣梭子蟹樣品，取生物體肌肉、肝胰腺組織，勻漿，迅速冷凍，以備分析。同時，采集水體樣品，存放于–20℃冰箱備用。

蓄積實驗結束后，將余下的三疣梭子蟹移入盛有天然海水的水箱內進行體內總砷的釋放實驗。每天定時、定量喂食和換水(與蓄積實驗相同)，分別于第18、20、25、30 天采集三疣梭子蟹樣品，取生物體肌肉、肝胰腺組織，勻漿，迅速冷凍，以備分析。同時，采集水體樣品，存放于–20℃冰箱備用。

1.3.3 樣品前處理 參照《食品中總砷及無機砷的測定中的方法》(GB 5009.11–2014)，采用濕法消解法對所取樣品進行消解，準確稱取1～2 g (精確至0.01 g)樣品放入消化管，向消化管中分別加入8 ml 濃硝酸和2 ml 高氯酸，靜置過夜使樣品組織初步消解。后經X42A 鋁模塊自動消化裝置高溫加熱消解至管內有大量白煙冒出，管底約剩1 ml 澄清透明溶液后，將得到的內溶物移入100 ml 容量瓶使用蒸餾水定容，采用原子熒光光度計進行檢測，檢測的同時進行試劑空白實驗。

1.4 數據處理與實驗應用模型

1.4.1 數據處理 采用Excel 2003 軟件對數據進行計算和非線性擬合；采用SPSS13.0 軟件進行顯著性差異分析；使用Origin 7.5 軟件繪圖。

1.4.2 實驗應用模型 在重金屬的富集研究過程中，雙箱動力學模型能較好地描述水體與生物體之間的作用過程(Kahle et al, 2002)，通常假設污染物在生物體內的生物富集，可以近似看作是污染物在水體和生物體之間的兩相分配過程，因此，其吸附、解吸過程可用一級動力學過程進行描述。目前，許多應用研究都運用了該模型(王亞煒等, 2008; 張聰等, 2012;Martins et al, 2012; 苑旭洲等, 2012), 其主要描述見圖1。

圖1 生物富集雙箱動力學模型Fig. 1 Model of two-compartment bioconcentration

從圖1 可以看出，k1為生物富集速率常數，k2為生物排出速率常數，kv為水體的揮發常數，kM為生物的代謝速率常數，Cw為水體重金屬濃度(mg/L)，CA為生物體內重金屬濃度(mg/kg)。

水相(含有重金屬污染物的水體)公式：

生物體相公式：

式中，t 為實驗進行的時間(d)，t*為富集階段結束的時間(d)，C0為實驗開始前生物體內金屬的濃度(mg/kg)。由方程(3)和方程(4)對富集和釋放進行非線性擬合即可得到k1和k2。

理論上，在平衡狀態下，生物富集系數(BCF)和生物學半衰期B1/2分別使用以下公式得到：

雙箱動力學模型可用來計算即使沒有達到濃度平衡情況下，理論平衡狀態下的動力學參數。

2 結果

2.1 水體中總砷的濃度

從表1 可以看出，對照組第30 天水體中的總砷濃度低于對照組其他天數的取樣點，原因可能是海水批次不同。在富集階段，各實驗組水體中總砷濃度比實驗設置的濃度稍微偏低，可能是隨著三疣梭子蟹的濾食等行為，有少量的As 被攝入，導致實際測得的濃度低于實驗設置的濃度。而在釋放階段，實驗組與對照組相比，實驗組水體中總砷濃度高于對照組，且高濃度組水體中總砷的濃度比低濃度組稍高，且隨著時間的推移，總砷濃度有所降低，但總體下降幅度較小，表明在釋放階段三疣梭子蟹體內的As 隨著代謝有一定程度的釋放，且隨著時間的推移，釋放明顯減弱或者基本無明顯釋放。同時，實驗組中三疣梭子蟹身體表面富集的As 也會在釋放過程中重新釋放到水體中，這也可能導致實驗組水體中總砷濃度高于對照組。

表1 水體中總砷的濃度(μg/L)Tab.1 The concentration of total arsenic in water (μg/L)

2.2 三疣梭子蟹肝胰腺中總砷的生物富集及釋放結果

圖2 肝胰腺中總砷的濃度Fig.2 The concentration of total arsenic in hepatopancreas

圖3 肌肉中總砷的濃度Fig.3 The concentration of total arsenic in muscle

在富集實驗階段，與對照組取樣點相比，5、20和100 μg/L 實驗組中，每個對應的取樣點肝胰腺總砷濃度均有顯著升高(P<0.05)。除20 μg/L 組第5 天與第10 天總砷濃度無顯著差異外，其他各實驗組中，三疣梭子蟹肝胰腺總砷濃度均隨著暴露時間的增加而顯著增加(P<0.05)，且前5 d 增長速度較快，5 d 以后增長速度減緩，在富集實驗結束(15 d)時，總砷濃度達到最大值，5、20 和100 μg/L 實驗組的總砷濃度依次為3.447、3.754 和4.004 mg/kg (濕重)。在釋放實驗階段，高濃度組三疣梭子蟹肝胰腺中總砷的釋放比低濃度組快，到釋放實驗結束(30 d)時，各實驗組中的總砷濃度仍顯著高于空白組(P<0.05) (圖2)。

2.3 三疣梭子蟹肌肉中總砷的生物富集及釋放結果

在富集實驗階段，三疣梭子蟹肌肉中總砷濃度的增長趨勢同肝胰腺類似，均隨著時間的增加而增加，在0～5 d 中，總砷濃度顯著增加(P<0.05)，5～ 15 d 上升趨勢不變，但相較0～5 d 的快速上升，其總砷濃度進入平穩期，在富集實驗結束(15 d)時，總砷濃度達到最大值，5、20 和100 μg/L 實驗組的總砷濃度分別為1.426、1.684 和1.770 mg/kg(濕重)；在釋放實驗15～20 d 時，肌肉中的總砷有較為明顯的排出，其中，20 μg/L 實驗組肌肉中總砷濃度降低較快，20 d 以后，20 和100 μg/L 濃度組肌肉中總砷濃度基本趨于不變。與肝胰腺中相同，到釋放實驗結束(30 d)時，各實驗組中的總砷含量仍顯著高于對照組(P<0.05) (圖3)。

2.4 三疣梭子蟹對總砷的生物富集動力學參數

根據雙箱動力學模型對實驗得到的數據進行計算，然后再根據公式(3)～公式(6)，分別得到三疣梭子蟹對總砷生物富集的其他動力學參數k1、k2、BCF、B1/2。三疣梭子蟹對總砷的生物富集動力學參數見表2。

從表2 可以看出，5、20 和100 μg/L 實驗組中肝胰腺的BCF 分別為21.21、15.07 和10.31，B1/2分別為5.92、4.36 和3.00。因此，三疣梭子蟹肝胰腺對總砷的富集能力由低到高濃度逐漸降低，代謝能力逐漸增強。其中，k1隨水體中As 暴露濃度的增加而減小，k2隨水體中As 濃度的增加而增加。肌肉中，5 和100 μg/L 實驗組各動力學參數較為接近，但20 μg/L實驗組的k1最小，k2最大，因此，其BCF 和生物學半衰期最小。

表2 三疣梭子蟹對不同濃度下總砷的各生物富集動力學參數Tab.2 The kinetic parameters of bioconcentration of total arsenic by P. trituberculatus in the different concentration

3 討論與結論

在本研究中，三疣梭子蟹肝胰腺組織對總砷的富集能力比肌肉組織高。肝胰腺中，總砷的濃度在富集實驗結束(15 d)時顯著高于肌肉，并且與 Perry 等(2015)、Ghaeni 等(2015)、Cheng 等(2018)大部分研究的結果相一致。

總體上來看，不同濃度實驗組中，肝胰腺的總砷濃度隨著水體中As 的濃度增加而增加，并且差異較為明顯；而不同濃度實驗組中，肌肉的總砷濃度隨著水體中As 濃度的增加而增加，但20 和100 μg/L 實驗組的結果相比無明顯差異。Yilmaz 等(2007)研究表明，重金屬離子在螃蟹體內器官的累積程度取決于器官的生理作用，肝胰腺作為螃蟹體內的代謝解毒器官被認為是金屬蓄積的靶器官，這也是肝胰腺對總砷的富集能力高于肌肉的主要原因。

總砷在三疣梭子蟹肝胰腺和肌肉中富集和釋放都是前期(0～5 和15～20 d)增加或降低迅速，后期(5～15和20～30 d)增加或降低趨于緩慢，這與許高鵬等(2014)對苯并[a]芘在三疣梭子蟹體內的富集動力學研究結果相一致。在富集階段，總砷富集的動力主要是As從高濃度的水相向低濃度的生物相擴散的滲透勢能，隨著暴露時間的增加，生物相中富集總砷不斷增加，生物相–水相之間的滲透勢能也不斷降低，從而導致實驗中富集速率隨著時間推移不斷降低。而在釋放階段前期，總砷釋放的動力同樣是高濃度的生物相向低濃度的水相擴散的滲透勢能；在釋放階段后期，滲透勢能作用不斷降低，同時，部分As 和生物相中如谷胱甘肽、S-腺苷甲硫氨酸、巰基組氨酸三甲基內鹽、金屬硫蛋白以及其他生物大分子相結合(趙鳳, 2012;薛啟祥等, 2016; 李曉等, 2016)，從而導致實驗組生物相所含有的總砷高于對照組，并且這種趨勢隨著實驗組濃度增加而加重。