條斑紫菜絲狀體不同發育時期對光照和溫度的光合適應能力*

魏家慧 李國梁 汪文俊 梁洲瑞 魯曉萍 劉福利 孫修濤 張朋艷

(1. 中國水產科學研究院黃海水產研究所 農業農村部海洋漁業可持續發展重點實驗室 青島 266071；2. 上海海洋大學水產與生命學院 上海 201306；3. 青島海洋科學與技術試點國家實驗室海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室 青島 266071)

條斑紫菜(Pyropia yezoensis)是一種較為原始的 大型紅藻，主要分布在我國浙江舟山群島以北的東海和黃、渤海沿岸及朝鮮半島和日本沿海等地(許璞等,2013)。條斑紫菜具有很高的營養、經濟和生態價值，是我國重要的大型栽培海藻(李曉蕾等, 2017)。條斑紫菜生活史包括宏觀配子體(葉狀體)和微觀孢子體(絲狀體) 2 個異形世代(馬家海等, 1996)。絲狀體分為絲狀藻絲(營養藻絲)、孢子囊枝、殼孢子形成(張學成等, 2005) 3 個階段。環境適宜時，成熟的孢子囊枝放散殼孢子，繼而發育生成新的葉狀體。條斑紫菜葉狀體生長于潮間帶，藻體每天隨潮汐的變化，經受溫度、光照、鹽度及水分等環境因子的脅迫(Davison et al,2010)，是研究植物抗逆性及其機理的良好實驗材料。

目前，有關條斑紫菜的研究主要集中在適宜絲狀體生長發育的環境生態條件(郭文竹, 2012; 張美如等,2009)、葉狀體抗逆性及機制(侯和勝等, 2008; 周向紅等, 2013)與分子生物學等(賀劍云等, 2010; Yang et al,2011; Cao et al, 2018)。絲狀體是紫菜生活史的重要階段，作為種質資源保存形式，調控其生長發育對生產和科研十分重要。孢子囊枝和營養藻絲是紫菜絲狀體發育最典型的2 個階段，受環境因子影響顯著(Green et al, 2015)。高溫促進絲狀體由營養藻絲發育為孢子囊枝。研究表明，溫度達到12.5℃以上，才能形成孢子囊枝(任國忠等, 1979)；15℃～25℃之間，殼孢子囊枝的增長率與溫度成正比(陳翠芬等, 2008)。光是植物進行光合作用的能量來源，對植物體生長、發育具有重要影響(盧曉等, 2014; 夏云捷等, 2016)。光強過高或過低均不利于紫菜絲狀體的生長和發育。駱其君等(1999)研究表明，15℃、60 μmol/(m2·s)是條斑紫菜絲狀體適宜的溫度和光照。陳翠芬等(2008)研究發現，8 L ∶16 D的短日照光周期、57 μmol/(m2·s)光強下，殼孢子囊枝形成率最高。Zhong 等(2016)對長紫菜(Pyropia dentata)絲狀體發育研究表明，較高溫度有利于孢子囊枝的形成；在不高于12 h 日照情況下，孢子囊枝形成率隨日照時間的延長而增加；在一定的光照范圍內，孢子囊枝的形成隨光強的增加而增加。

紫菜發育和有性生殖的調控與環境緊密關聯，而這個過程藻體光合作用也會發生相應變化(Katz et al,2000; Jiang et al, 2013)。紫菜絲狀體發育階段，營養藻絲和孢子囊枝在形態上存在巨大差異(Shen et al,2000; Varela-Alvarez et al, 2004; 周文君等, 2006)，對環境因子需求也有所不同，但二者在不同環境條件下的光合生理差異尚未明確。本研究通過葉綠素熒光技術和液相氧電極技術，對條斑紫菜自由絲狀體營養藻絲與孢子囊枝階段在不同溫度與光強下的光合生理進行比較研究，以比較二者光溫適應能力，尤其是對高溫和高光脅迫的光合耐受性，旨在為揭示條斑紫菜絲狀體發育光溫調控機制、建立苗種繁育精準調控技術奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

采用課題組培育的條斑紫菜“黃優1 號”品系為實驗材料。營養藻絲和孢子囊枝暫養條件：20℃，光強30 μmol/(m2·s)，光周期12 L ∶12 D，滅菌海水中添加營養鹽(5 mg/L-N，1 mg/L-P)為培養液。培養適應3 d 后進行實驗。

1.2 實驗方法

1.2.1 溫度和光強對絲狀體Fv/Fm的影響 實驗于DGXM-508B 光照培養箱中進行，稱取等量營養藻絲和孢子囊枝分別放于培養皿中。設置3 個溫度(15℃、25℃和35℃)和3 個光強[40、100 和300 μmol/(m2·s)]。分別測定不同光溫組合培養6 h、1 d、2 d 和3 d 的Fv/Fm。Fv/Fm測定采用葉綠素熒光儀(Imaging-Pam,WALZ, 德國)，方法：取少量藻體于暗盒中，分別進行20 min 暗適應，每個樣品取6 個平行，測定其Fv/Fm。

1.2.2 溫度和光強對絲狀體Pg、Rd和Pn的影響實驗設置同 1.2.1，采用液相氧電極(Hansatech Oxygraph, 英國)測定，反應介質為滅菌海水，光源為500 W 碘鎢燈，通過控制燈的遠近，將光強控制在40 μmol/(m2·s)。每個條件下反應穩定5 min，測試時間控制在10 min 內，取較為平滑曲線計算。由氧電極自帶軟件得出數據，每個處理組設置3 個平行。

1.3 數據處理

采用Excel 分析數據并繪圖，采用SPSS 18 軟件對各組數據進行單因子方差分析(One-way ANOVA)及Duncan 多重比較，P<0.05 為差異顯著。

2 結果

2.1 溫度和光強對營養藻絲和孢子囊枝 Fv/Fm 的影響

15℃時，除40 μmol/(m2·s)光強組，其他實驗組孢子囊枝的Fv/Fm均顯著高于營養藻絲(P<0.05)，此現象隨光強增加而越明顯，且二者Fv/Fm均隨光強增加而下降。光強為40 μmol/(m2·s)時，6 h～2 d 內，孢子囊枝與營養藻絲的Fv/Fm均呈上升趨勢，3 d 時顯著下降(P<0.05)，2 種藻絲的Fv/Fm在最優時相當。100 μmol/(m2·s)光照下，孢子囊枝的Fv/Fm呈線性下降趨勢；當光強達到300 μmol/(m2·s)時，第3 天時，孢子囊枝的Fv/Fm顯著降低(P<0.05)；在光強為100～300 μmol/(m2·s)時，營養藻絲的Fv/Fm一直處在非常低的水平(P<0.01)。

圖1 15℃下，不同光強對條斑紫菜絲狀體Fv/Fm 的影響Fig.1 Fv/Fm of P. yezoensis under different light intensities at 15℃

溫度為25℃時，孢子囊枝的Fv/Fm均顯著高于營養藻絲(P<0.05)，但不同光強下情況不同：光強為40與100 μmol/(m2·s)組情況相同，營養藻絲Fv/Fm變化不大，孢子囊枝的Fv/Fm先下降(P<0.05)，后有所恢復。當光強達到300 μmol/(m2·s)時，營養藻絲Fv/Fm趨近于零，藻體發綠變白，接近死亡；孢子囊枝Fv/Fm先上升后有所下降(P<0.05)；但二者Fv/Fm均顯著低于40～100 μmol/(m2·s)組(P<0.05)。

圖2 25℃不同光強對條斑紫菜絲狀體Fv/Fm 的影響Fig.2 Fv/Fm of P. yezoensis under different light intensities at 25℃

35℃時，營養藻絲與孢子囊枝的Fv/Fm顯著低于15℃和25℃組。不同光強下，營養藻絲的Fv/Fm幾乎檢測不到(P>0.05)。40～100 μmol/(m2·s)光強下，孢子囊枝在培養初期(6 h)，Fv/Fm隨光強增加而急劇下降；當光強為300 μmol/(m2·s)時，孢子囊枝在6 h 的Fv/Fm幾乎為0。營養藻絲在6 h 時，藻體變綠發白，孢子囊枝在1～2 d 后，藻體也變綠發白、死亡。

圖3 35℃不同光強對條斑紫菜絲狀體Fv/Fm 的影響Fig.3 Fv/Fm of P. yezoensis under different light intensities at 35℃

2.2 溫度和光強對絲狀體總光合速率的影響

15℃時，孢子囊枝的總光合速率均顯著高于營養藻絲(P<0.05)。隨光強的增加，二者Pg逐漸降低。40 和100 μmol/(m2·s)光照下，孢子囊枝Pg呈遞增趨勢，營養藻絲則呈先上升后下降的趨勢(P<0.05)。300 μmol/(m2·s)時，第2 天，營養藻絲出現顯著上升后又急劇下降，其余各組間無顯著差異(P>0.05)。

圖4 15℃不同光強對條斑紫菜絲狀體總光合速率的影響Fig.4 Gross photosynthesis rate of P. yezoensis under different light intensities at 15℃

當溫度為25℃、光強為40 μmol/(m2·s)時，孢子囊枝Pg隨培養時間延長而線性上升(P<0.05)，營養藻絲各組間無顯著差異。3 個組變化情況與15℃大體一致，且孢子囊枝Pg顯著高于營養藻絲(P<0.05)。

當溫度為35℃、光強為40 μmol/(m2·s)時，培養1 d 孢子囊枝的Pg上升顯著(P<0.05)；第2 天，營養藻絲Pg降為負值(P<0.05)，孢子囊枝Pg幾乎為0(P<0.05)；第3 天，營養藻絲恢復到6 h 水平。光強為100 μmol/(m2·s)時，2 種藻絲的總體變化趨勢和40 μmol/(m2·s)時大體一致。300 μmol/(m2·s)脅迫下，6 h～2 d 中，營養藻絲和孢子囊枝的Pg在0 上下波動，變化趨勢不顯著；第3 天時，營養藻絲的Pg上升顯著(P<0.05)。

圖5 25℃不同光強對條斑紫菜絲狀體總光合速率(Pg)的影響Fig.5 Gross photosynthesis rate of P. yezoensis under different light intensities at 25℃

圖6 35℃不同光強對條斑紫菜絲狀體總光合速率(Pg)的影響Fig.6 Gross photosynthesis rate of P. yezoensis under different light intensities at 35℃

2.3 溫度和光強對絲狀體呼吸耗氧速率的影響

溫度為15℃時，光強為40 μmol/(m2·s)時，1 d時孢子囊枝與營養藻絲的Rd均顯著上升(P<0.05)隨后維持較為穩定的水平。當光強達到100 μmol/(m2·s)時，6 h 時營養藻絲的Rd顯著高于孢子囊枝(P<0.05)，隨脅迫時間延長，孢子囊枝Rd逐漸升高，且顯著高于營養藻絲(P<0.05)。光強300 μmol/(m2·s)時，實驗前期，營養藻絲和孢子囊枝Rd呈上升趨勢，且二者之間無顯著差異(P>0.05)。

溫度達到25℃時，光照為40 μmol/(m2·s)時，營養藻絲的Rd均顯著高于孢子囊枝(P<0.05)，且二者均呈上升趨勢，此現象在孢子囊枝中尤為顯著。光照為100 μmol/(m2·s)時，營養藻絲和孢子囊枝的Rd均呈先上升后下降趨勢(P<0.05)。300 μmol/(m2·s)光強脅迫下，6 h 時，營養藻絲Rd顯著高于孢子囊枝(P<0.05)，6 h～2 d 時，孢子囊枝Rd上升(P<0.05)，其余時間二者均無顯著差異。

在35℃高溫、40 μmol/(m2·s)光照脅迫下，營養藻絲和孢子囊枝的Rd波動較大，呈先上升后下降再上升的趨勢，第1 天時，孢子囊枝Rd顯著高于營養藻絲(P<0.05)。100 μmol/(m2·s)光強中，6 h～1 d 中，二者Rd呈顯著上升(P<0.05)，孢子囊枝的Rd顯著高于營養藻絲。光強達到300 μmol/(m2·s)時，二者Rd與前2 組光照實驗相比均有明顯下降(P<0.05)，實驗過程中，營養藻絲與孢子囊枝Rd均呈上升趨勢，且實驗后期營養藻絲Rd顯著高于孢子囊枝(P<0.05)。

圖7 15℃不同光強對條斑紫菜絲狀體呼吸耗氧速率(Rd)的影響Fig.7 Respiratory oxygen consumption rate of P. yezoensis under different light intensities at 15℃

圖8 25℃不同光強對條斑紫菜絲狀體呼吸耗氧速率(Rd)的影響Fig.8 Respiratory oxygen consumption rate of P. yezoensis under different light intensities at 25℃

圖9 35℃不同光強對條斑紫菜絲狀體呼吸耗氧速率(Rd)的影響Fig.9 Respiratory oxygen consumption rate of P. yezoensis under different light intensities at 35℃

2.4 溫度和光強對絲狀體凈光合速率的影響

營養藻絲的凈光合速率(Pn)均為負值。孢子囊枝在15℃和25℃時Pn為正值，且隨光強增加而下降；當溫度達到35℃時，Pn急劇降低為負(表1)。

表1 溫度、光照對條斑紫菜營養藻絲和孢子囊枝凈光合速率(Pn)的影響Tab.1 The net photosynthetic rate of vegetative conchocelis and conchosporangial branches under different light intensities and temperatures

3 討論

藻類進行光化學反應和電子傳遞的成分位于葉綠體類囊體膜上(Chow et al, 2005)，葉綠素熒光參數可以反映PSⅡ的活性以及對光能吸收、傳遞、分配、耗散等內在性的聯系(Maxwell et al, 2000)。當藻類在逆境條件下產生光抑制時，葉綠素各熒光參數均呈下降趨勢(Zhou et al, 2004)。PSⅡ原初光能轉化效率Fv/Fm反映植物在充足的暗適應后，所有PSⅡ反映中心均處于開放狀態時的量子產量，是衡量植物光合系統完整性的指標之一(張守仁, 1999)。當植物遭遇外界脅迫時，Fv/Fm值存在不同程度的下降，則表明PSⅡ反應中心受到不同程度的損傷?？偣夂纤俾?Pg)表示在光照條件下，單位時間內(葉綠體)所合成的有機物的量或同化CO2的量，表觀光合速率(Pn)表示單位時間內植物所積累的有機物含量或者從外界環境所吸收CO2量(陳衛東, 2018)，由總光合速率(Pg)減去呼吸耗氧速率(Rd)所得。溫度變化會影響藻細胞新陳代謝、種群增長和葉綠素含量(梁英等, 2009)。溫度過高或過低均會使藻體生長緩慢，甚至死亡(張美如等,2009)。低溫可以使植物類囊體膜上PSⅡ反應中心功能受到抑制(Terashima et al, 1989)，降低PSⅡ的修復能力(Ottander et al, 1993)；同時，PSⅡ也是對高溫傷害最敏感的結構(Berry et al, 1980)。光是植物進行光合作用的能量來源，適宜的光強是保證植物正常生長發育的前提，但光強過高，則會對植物光合作用產生光抑制(鄭寶福等, 1980; 陳國宜等, 1984; Zhang et al,1997)。植物適應或抵抗外界脅迫過程需要消耗大量能量，呼吸作用為植物生命活動提供大部分能量，通過增強呼吸作用來抵抗脅迫是植物抗逆途徑之一。

溫度和光照是影響紫菜絲狀體生長發育的2 個最基本環境要素。通常在一定的光照和溫度范圍內，較高的溫度、中短日長和較強的光照促進絲狀體由營養藻絲發育為孢子囊枝(任國忠等, 1979; 駱其君等,1999; 陳翠芬等, 2008; 盧曉等, 2014; 夏云捷等, 2016;Zhong et al, 2016)，但有關調控機制尚不清楚。實踐工作中，營養藻絲在適宜的情況下，只要培養條件不變，可以長久維持營養生長，而不會向孢子囊枝轉化。那么，光溫的升高是否因不利于營養藻絲的生長，從而啟動相關內源信號調控藻絲轉向另一個發育階段？為了驗證這一假設，本研究設置溫度和光照強度較大，包括適宜范圍與極端脅迫。結果顯示，在適宜溫度范圍內(15℃～25℃)，除了溫度為15℃、光強為40 μmol/(m2·s)時，二者在多數時間點的Fv/Fm相當，其他條件下，孢子囊枝的Fv/Fm、Pg與Pn均高于營養藻絲(P<0.05)。營養藻絲在25℃時，Fv/Fm、Pg與Pn值均低于15℃時，而孢子囊枝在25℃時，以上3 個指標均高于或相當于15℃時，說明孢子囊枝比營養藻絲適于更高的溫度。這從Rd的變化也可以看出，2 種藻絲在15℃時，Rd差距不顯著，在溫度為25℃、光強為40 μmol/(m2·s)時，6 h～1 d 時，營養藻絲顯著高于孢子囊枝。光合作用降低、呼吸作用增強是植物遭遇脅迫時的常見反應。因此，推測營養藻絲在溫度為25℃、光照強度為40 μmol/(m2·s)時已受到脅迫。研究表明，35℃對紫菜絲狀體已是致死高溫脅迫，2 種藻絲的Fv/Fm趨于0，出現藻體死亡現象。2 種藻絲的以上光合生理指標基本上都隨實驗光強的增加而下降。說明過高的光強可以顯著降低絲狀體PSⅡ的光能利用效率。溫度為15℃、光強為40 μmol/(m2·s)時，營養藻絲和孢子囊枝在多數時間點具有相近的Fv/Fm值，相同溫度下，光強增加至100 μmol/(m2·s)，孢子囊枝Fv/Fm值則顯著高出營養藻絲；在溫度為15℃～25℃、光照為300 μmol/(m2·s)時，雖然孢子囊枝的光合生理指標數值相比溫度為15℃～25℃、光強為40～100 μmol/(m2·s)時有所下降，但還維持在較高水平，而營養藻絲的數值已降至0 附近，可見孢子囊枝對高光的耐受性顯著高于營養藻絲。

孢子囊枝相對營養藻絲具備適應更高溫度和光照的能力，可能與其在結構和成分上的改變有關。超微結構顯示，首先，孢子囊枝中央液泡形成并增大(沈頌東等, 2000)，液泡在多種逆境條件下起積極的滲透調節作用；第二，線粒體體積增大，數量變多(沈頌東等, 2000)。線粒體是進行呼吸代謝和能量轉換的主要場所，細胞生命活動所需的能量大約有95%來自線粒體(Chance et al, 1979)，條斑紫菜孢子囊枝中線粒體增多可能為機體抵抗外界脅迫提供了能量保障；第三，色素體被擠壓分散排列在細胞邊緣，并由大量的線粒體和淀粉粒分割開來(周文君等, 2006)，極大提高了光能的吸收利用效率和有機物合成(光合碳固定)；第四，細胞壁增厚疏松，外膠層變薄，內纖維質層極度加厚，細胞外壁凹凸不平，形成脊突，并隨孢子囊枝日益成熟數量明顯增加(朱家彥等,1984)。植物細胞壁增厚是抵御逆境脅迫的有效途徑之一(莊惠如等, 2001)。另外，前期研究表明，在紫菜絲狀體發育過程中，磷脂酰膽堿(PC)和溶血磷脂酰膽堿(LPC)含量增加(Wang et al, 2015)。PC 對PSⅡ膜復合物有保護作用(李冬海等, 2003)，可以增強其放氧速率(Gounaris et al, 1983)，同時，還可誘導Triton處理的光系統膜復合物的再活化(Ruan et al, 2002)。PC 脂?；鶄孺湹牟伙柡统潭葘φ{節細胞的高溫/低溫適應能力具有重要影響。LPC 是植物抗逆過程中重要的信號傳遞物質(盧靜嬋等, 2012)。同時，孢子囊枝中藻膽蛋白含量及其與葉綠素a 含量的比值等均有所上升(陳燁等, 2007)。藻膽蛋白為紅藻主要捕光色素(姚南瑜, 1987)，直接參與光合作用能量吸收和傳遞(Glazer, 1984)，同時，還具有抗逆功能(Zhong et al,2016)。孢子囊枝藻膽蛋白含量上升，可增加光能捕獲效率，促進光反應和碳水化合物合成。研究發現，在壇紫菜絲狀體由營養藻絲發育到孢子囊枝過程，碳水化合物和蛋白質比值明顯上升(陳燁等, 2007)。碳水化合物是細胞結構的主要成分和主要供能物質，碳水化合物的含量及其與蛋白質的比值是植物響應脅迫的重要指標，如，鷹嘴豆(Cicer arietinum)在干旱脅迫下，水溶性碳水化合物的含量顯著升高(Mafakheri et al, 2011)；細基江蘺(Gracilaria tenuistipitata var.

Liui)碳水化合物和蛋白質比值隨溫度的降低和光照的減弱下降(劉靜雯等, 2001)。紫菜孢子囊枝細胞內這些結構和組成的改變，為孢子囊枝應對高溫和高光脅迫提供了支撐。

綜上所述，在條斑紫菜營養藻絲的光合作用被嚴重抑制的光強、溫度條件下，孢子囊枝仍然具備相對高的光合活力，說明溫度和光強升高到不利于營養藻絲生長的情況下，刺激藻絲轉向孢子囊枝發育階段，后者同時具備適應更高溫度和光照的能力。育苗實踐中，可利用二者對高溫/高光耐受閾值的差異來調控絲狀體的生長和發育。