重金屬對不同地區鱸魚酶活及性激素的相關性分析

劉 源

（河南科技大學 食品與生物工程學院，河南洛陽 471023）

重金屬污染是指重金屬及其化合物對大氣、水、土壤等造成的環境污染。重金屬污染對海洋生物的生長與繁殖的影響日趨嚴重[1]，海洋中的重金屬吸附于懸浮顆粒，隨沉淀物沉沒于水底。因此，重金屬污染極難被生物降解[2-5]，且重金屬經過生物的富集的作用，通過食物鏈進入人體，并對人體造成一系列的健康問題。隨著我國居民生活水平的提高，海洋魚類也成為了餐桌上必不可少的食物，而鱸魚又因其營養價值高、味道鮮美、肉質細嫩成為廣大食客的首選魚類。

金屬硫蛋白（MT） 是能與多種重金屬結合的一類低分子蛋白[6]，并會對機體內的重金屬含量具有調節作用，從而達到維持其在機體內的平衡目的[7-8]。GST 酶和EROD 酶是有機污染物及其化合物在體內轉化過程中重要的酶，可以通過酶的活性來預測其在生物體內的污染情況[9]。近海沉淀物中的有機污染物會使EROD 酶的活性升高[10]。在某些重金屬離子的脅迫作用下，可促進EROD 酶的活力，因此其可作為一個監測水體重金屬污染的指標。國內外的大多數研究集中于有機污染物的影響研究，重金屬與多環芳烴在不同營養級的富集是一個動態復雜的過程，多環芳烴會引起EROD 酶活性的上升，重金屬對魚類體內EROD 微粒體同樣具有體內和體外的誘導作用[11]。國內外在重金屬對魚類生殖方面研究比較單一，多種金屬元素與性激素的相關性研究鮮有報道，且雌二醇和睪酮的含量對魚類性腺的發育、成熟起著重要的作用。羅永巨[12]研究發現重金屬鎘會使雌二醇的含量升高，在鎘的脅迫作用下，羅非魚的孵化率降低，畸形率升高。

試驗研究了5 個不同地區鱸魚體內14 種重金屬的含量與MT、酶活性及性激素含量的相關性，探究了14 種重金屬元素在魚體內的富集情況與MT、酶活性及性激素含量的關系，為該地區重金屬在海洋生態及海洋魚類的污染情況提供理論數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與主要儀器

材料：于A，B，C，D，E 等5 個地區隨機捕撈鱸魚各22 條。

試劑：5,5' -二硫硝基苯甲酸（DTNB），西安赫特生物科技有限公司提供；乙二胺四乙酸二鈉（EDTA），美國Sigma 公司提供；三羥甲基氨基甲烷（Tries-HCl），天津百倫斯生物技術有限公司提供；GST 酶試劑盒、EROD 酶試劑盒，上海江萊生物科技有限公司提供；E2 和T 試劑盒，上海橋杜生物科技有限公司提供。

儀器：PinAAcle 900H 型原子吸收光譜儀，美國Perkin Elmer 公司產品；Multiwave PRO 型微波消解儀，奧地利Anton Paar 公司產品；H2500R 型高速冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司產品；FA1004B 型電子天平，上海精密儀表有限公司產品；680 型全自動酶標儀，美國Bio-Rad 公司產品，UV2600 型紫外可見分光光度計，日本Shimadzu 公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品預處理

將各地區捕撈的鱸魚置于魚缸中，為確保其活力，進行沖氧并分別進行編號1～22，然后運回實驗室對其解剖并進行指標測定。

1.2.2 不同地區魚體內重金屬元素含量測定

稱取魚樣約0.2 g 置于25 mL 的消解罐中，加入8 mL HNO3和4 mL H2O2，室溫條件下消解過夜，然后在120 ℃條件下消解3 h，將消解液置于50 mL 的容量瓶中進行定容。取消解液50 μL，進行重金屬的測定。該原子吸收光譜為火焰-石墨爐一體機。

1.2.3 不同地區鱸魚體內金屬硫蛋白（MT） 的測定

參照嚴國等人[13]的方法稍作修改。稱取新鮮魚樣10.000 g，剁碎，顆粒盡量細小，然后在高速均質機內均質3 次，每次1 min，取1.000 g 加入0.1 mol/L的Tris-HCl 緩沖液6 mL，在4 ℃環境下搖勻，抽提8 h；將該液體置于4 ℃下以轉速12 000 r/min 離心5 min，收集上清液；于90 ℃水浴下加熱3 min，降至室溫，以轉速12 000 r/min 離心5 min，收集上清液；加入3 mL 的無水乙醇，于-18 ℃下沉淀12 h；再以轉速12 000 r/min 離心5 min；取沉淀加入0.1 mol/L Tris-HCl 緩沖液5 mL 溶解2 h；以轉速12 000 r/min 離心5 min，收集上清液用于測定MT 含量。

1.2.4 不同地區鱸魚體內酶活性的測定

按1.2.3 處理魚樣，取5.000 g 加入PBS 緩沖液勻漿機內勻漿，在高速冷凍離心機里以轉速20 000 r/min離心10 min 后取上清液，對GST 酶和EROD 酶活性的測定按試劑盒的步驟進行測定。

1.2.5 不同地區鱸魚血清內性激素含量測定

將稱好質量的魚肉組織，加入質量10 倍體積的PBS 緩沖溶液溶液。隨后進行組織勻漿。組織勻漿好后，在4 ℃下以轉速20 000 r/min 離心5 min。隨后收集勻漿液的上清液。性激素的含量按上海橋杜生物科技有限公司提供的說明書進行測定。

2 結果與分析

2.1 A 地區鱸魚體內重金屬與MT，GST，EROD，E2，T 睪酮的相關性分析

金屬硫蛋白易與重金屬結合，在調節魚體內重金屬的平衡起著重要的作用，不同地區的重金屬含量存在差異，機體的調節能力也存在個體差異。Se元素是人體必需的微量元素之一，在酸性條件下，金屬硫蛋白的金屬易解離出來；在中性介質下，該解離的蛋白又會與Se 結合形成類金屬硫蛋白[14]。從表1 可以看出，A 地區Se 的含量與MT 呈正相關（p＜0.05），相關系數為0.51；對該地區而言，可以根據金屬硫蛋白的含量大致反映出Se 在魚體內的富集狀況。性激素的含量能夠體現魚體的孵化、生長及繁殖情況，As 的含量與E2 呈極顯著負相關（p＜0.01），相關系數為-0.59，可見As 的含量越高，魚體所分泌的雌二醇越低；Zn 的含量與T 睪酮呈負相關（p＜0.05），相關系數為-0.42，重金屬Zn 的含量高，則會引起睪酮的分泌量減少。A 地區重金屬含量與GST 酶及EROD 酶的活性不具有相關性。

A 地區鱸魚體內重金屬與MT，GST，EROD，E2，T 睪酮的相關性分析見表1。

2.2 B 地區鱸魚體內重金屬與MT，GST，EROD，E2，T 睪酮的相關性分析

海水中的重金屬大多以與懸浮的顆粒相結合的形式存在，另一方面是工業生產及人類生活產生的污染（該污染物大多是與有機物結合，形成難以分解的有機物污染物）。

表1 A 地區鱸魚體內重金屬與MT，GST，EROD，E2，T 睪酮的相關性分析

B 地區鱸魚體內重金屬與MT，GST，EROD，E2，T 睪酮的相關性分析見表2。

由表2 可知，B 地區Se 的含量與MT 呈顯著正相關（p＜0.05），相關系數為0.46，可見金屬硫蛋白在該地區與Se 的結合能力要強于另外13 種元素；As 的含量與EROD 酶呈顯著負相關（p＜0.05） 相關系數為-0.45。EROD 酶是重金屬在魚體內轉化的重要酶，EROD 酶的活性越高，重金屬As 的含量越低?？梢?，魚體為了維持體內As 的平衡，EROD 酶通過將體內含重金屬As 的污染物分解，從而排出機體外。對于B 地區而言，重金屬含量與雌二醇和睪酮不存在相關性。因此，為了了解該地區鱸魚生長狀況，可對試驗之外的重金屬進行測定，從而確定是否存在某一重金屬與雌二醇及睪酮存在相關性。

表2 B 地區鱸魚體內重金屬與MT，GST，EROD，E2，T 睪酮的相關性分析

2.3 C 地區鱸魚體內重金屬與MT，GST，EROD，E2，T 睪酮的相關性分析

C 地區鱸魚體內重金屬與MT，GST，EROD，E2，T 睪酮的相關性分析見表3。

由表3 可知，C 地區As 的含量與MT 呈顯著正相關（p＜0.05），相關系數為0.44，該地區在魚體內As 元素結合金屬硫蛋白的能力最強；Sn 的含量與EROD 酶呈極顯著負相關（p＜0.01），相關系數為-0.53，EROD 酶的活性越高，重金屬Sn 的含量越低，因此該區域的鱸魚對重金屬Sn 在其體內的平衡具有一定的調節作用；Sn 的含量與T 睪酮呈顯著負相關（p＜0.05），相關系數為-0.42，魚體內Sn 的含量較高時，睪酮的分泌量減少，從而對鱸魚在該區域的生長產生不利的影響；Ba 的含量與T 睪酮呈顯著正相關（p＜0.05），相關系數為0.47，魚體內Ba 的含量在較高的水平下，鱸魚睪酮的分泌量較多。由于某些重金屬之間存在的競爭機制，因而機體的生長狀況要綜合多方面的因素進行考量。重金屬含量與GST 酶不具有相關性。

表3 C 地區鱸魚體內重金屬與MT，GST，EROD，E2，T 睪酮的相關性分析

2.4 D 地區鱸魚體內重金屬與MT，GST，EROD，E2，T 睪酮的相關性分析

D 地區鱸魚體內重金屬與MT，GST，EROD，E2，T 睪酮的相關性分析見表4。

由表4 可知，D 地區重金屬Ni、Ag 和Cr 的含量與MT 呈極顯著正相關（p＜0.01），相關系數分別為0.55，0.63，0.55；重金屬V、Cu 和Ba 的含量與MT 呈顯著正相關（p＜0.05） 相關系數分別為0.51，0.44，0.51，該水域內鱸魚體內重金屬Ni、Ag 和Cr與金屬硫蛋白的結合能力較強，重金屬元素V、Cu和Ba 與金屬硫蛋白的結合能力要弱于前3 種，重金屬元素與金屬硫蛋白結合能力為Ag＞Ni=Cr＞V=Ba＞Cu，其中重金屬元素Ag 結合金屬硫蛋白的能力最強，重金屬元素Cu 的結合能力最弱；Sn 的含量與MT 顯著負相關（p＜0.05），相關系數為-0.40；可見重金屬Sn 的含量較高時，金屬硫蛋白的含量較低。重金屬Cu 的含量與EROD 酶呈顯著正相關（p＜0.05），相關系數為0.43，可見重金屬元素Cu 含量在一定范圍內含量越高，EROD 酶活性越高，即在Cu2+的脅迫下，Cu2+具有誘導EROD 活力的能力，且起著促進作用，這與劉志[15]的研究結論相似。重金屬Co、V和Ba 的含量與E2 呈顯著負相關（p＜0.05），相關系數分別為-0.44，-0.42，-0.51；Cd 的含量與E2 呈極顯著負相關（p＜0.01） 相關系數為-0.67，重金屬元素對雌二醇的影響能力大小為Cd＞Ba＞Co＞V，Cd、Co、V 和Ba 的含量越高，雌二醇的含量越低，Cd 元素的影響最大；As 的含量與T 睪酮呈顯著正相關（p＜0.05），相關系數為0.41，重金屬元素的含量與GST 酶活力不存在相關性。

表4 D 地區鱸魚體內重金屬與MT，GST，EROD，E2，T 睪酮的相關性分析

2.5 E 地區鱸魚體內重金屬與MT，GST，EROD，E2，T 睪酮的相關性分析

E 地區鱸魚體內重金屬與MT，GST，EROD，E2，T 睪酮的相關性分析見表5。

由表5 可知，E 地區重金屬Ni、V、Cr、Mn、Ba 的含量，As 含量與MT 呈顯著正相關（p＜0.05），相關系數分別為0.47，0.49，0.47，0.47，0.46，0.42，該水域內重金屬元素與金屬硫蛋白的結合能力依次為V＞Ni=Cr=Mn＞Ba＞As，其中重金屬元素V 與金屬硫蛋白的結合能力最強，As 的結合能力最弱；重金屬Pb 的含量與GST 呈顯著正相關（p＜0.05），相關系數為0.45，重金屬元素Pb 的含量在一定范圍內，在Pb2+的脅迫作用下，其能夠促進GST 酶的活力提升，還有研究人員研究發現在Pb2+脅迫作用下河蜆GST 酶活力顯著的高于對照組（p＜0.05），這與該研究結論相一致?？梢愿鶕|魚體內GST 酶活力作為來監測水體中重金屬Pb2+的污染情況，該水域的重金屬元素與雌二醇及睪酮的含量不存在相關性。

表5 E 地區鱸魚體內重金屬與MT，GST，EROD，E2，T 睪酮的相關性分析

3 結論

（1） 5 個地區重金屬元素與金屬硫蛋白都具有相關性，且呈正顯著相關（p＜0.05），不同水域與金屬硫蛋白相結合的重金屬元素不同，其結合能力的大小不同。

（2） B 和E 水域內這14 種重金屬元素與鱸魚的雌二醇及睪酮的含量不具有相關性。

（3） 重金屬離子在一定的含量范圍內，在某種金屬離子（如Cu2+、Pb2+） 的脅迫作用下，會促進GST 酶或EROD 酶的活力，從而調節該金屬元素在鱸魚體內的含量，使細胞避免損傷。

（4） 可以根據鱸魚體內的GST 酶或EROD 酶的活力可以作為指標來監測某些重金屬元素在水體內的污染狀況，機體對重金屬元素具有調節能力且這種調節能力是有限的，金屬硫蛋白在其中起著至關重要的作用。