大豆胞囊線蟲病抗性候選基因GmPEBP4-1克隆及表達分析

郭 楊，陳立新，姜海鵬，戰宇航

（1.黑龍江省農業科學院博士后科研工作站，哈爾濱 150086；2.黑龍江省農業科學院園藝分院，哈爾濱 150069；3.東北農業大學農學院，哈爾濱 150030）

大豆胞囊線蟲?。⊿oybean cyst nematode，SCN）是由大豆胞囊線蟲（Heterodera glycinesIchinohe）引起的世界性大豆病害，給大豆生產造成毀滅性損失[1]。SCN分布廣、危害重、其休眠體（胞囊）存活時間長，是一種極難防治的土傳性病害。SCN可被劃分為多個生理小種，不同生理小種分布和致病程度不同，在我國大豆主產區1號、3號、4號生理小種分布最廣、出現頻率最高，其中4號生理小種致病力最強[2]。主要有輪作倒茬、化學藥劑、生物防治、合理施肥等防治措施，但效果不理想。選育和利用抗病品種是比較經濟、安全、有效的控制SCN方法[3]。目前，國際上使用最多的SCN抗源為PI88788和Peking（PI548402），但過度使用有限抗源已導致SCN群體轉移，失去對SCN的抗性[4]。因此，培育新SCN抗源對大豆生產發展具有重要作用。

常規育種由于周期長，優良性狀和不良性狀緊密連鎖，不易選育出具有多種優良性狀的大豆抗性品種。隨著分子生物學快速發展，通過基因工程和分子育種技術發掘和利用大豆胞囊線蟲抗性基因，已成為常規育種外極具潛力的培育抗胞囊線蟲大豆品種方法[5]。

SCN是一種受多基因控制的復雜數量性狀[6]。Cook等研究表明rhg1位點抗性由串聯排列的具有色氨酸/絡氨酸透性酶結構域的轉運子、SNAP蛋白和具有創傷誘導蛋白結構域的蛋白等3個基因拷貝數共同決定[7]。Liu等研究表明Rhg4位點抗性由絲氨酸羥甲基轉移酶（Serine hydroxyl methyltransferase，GmSHMT）決定，抗病品種和感病品種SHMT編碼區內單核苷酸突變（SNP）使SHMT酶底物結合位點氨基酸不同，致使成熟蛋白在催化性狀方面表現差異，影響合胞體內葉酸平衡，最終造成合胞體細胞環境改變導致線蟲死亡[8]。除rhg1和Rhg4位點外，Lin等研究表明水楊酸合成代謝及信號轉導途徑中GmSAMT基因發揮重要作用，在大豆根中表達顯著提高SCN抗性[9]。目前為止，這些抗性基因僅解釋部分抗源中SCN抗性，所以挖掘新抗病基因對SCN抗性育種及解析SCN抗性機制具有重要意義。

磷脂酰乙醇胺結合蛋白（Phosphatidyl ethanolamine-binding protein，PEBP）基因家族在植物、真菌、昆蟲和人類中廣泛存在。該基因家族在植物成花轉變、種子發育和萌發中發揮重要作用。目前，已在擬南芥、水稻、玉米和大豆等多種植物中分離較多PEBP基因[10]。通過研究PEBP基因家族功能發現，PEBP蛋白在植物體內參與MAPK/ERK信號通路調節細胞分化、遷移和黏附，NFKB信號通路調節細胞凋亡，GPCR信號通路調控G蛋白信號轉導等多個胞內信號通路[11]。目前PEBP功能研究主要集中在哺乳動物及模式作物擬南芥，大豆研究報道較少。轉錄組測序技術廣泛應用于大豆胞囊線蟲病抗性基因篩選[12]。所以本研究利用抗病材料東農L-10轉錄組測序結果，選取在大豆胞囊線蟲4號生理小種脅迫后差異表達的磷脂酰乙醇胺結合蛋白（PEBP）基因，命名為Gm-PEBP4-1。利用RT-PCR技術克隆抗病候選基因GmPEBP4-1，在生物信息學基礎上利用qRT-PCR技術分析該基因在抗、感SCN病材料中基因表達量。初步探討GmPEBP4-1基因在大豆胞囊線蟲脅迫后響應，以期為SCN抗性育種提供抗病基因資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理

抗大豆胞囊線蟲病材料“東農L-10”、“東農L-204”、“Kangxian2”和感病材料“黑農37”、“ 綏農14”、“綏農10”種子取自東北農業大學農學院大豆生物學教育部重點實驗室。大豆胞囊線蟲4號生理小種（HG type 1.2.3.5.7）采自東北農業大學大豆研究所試驗田，經Riggs和Schmitt鑒別模式[13]，鑒定結果為大豆胞囊線蟲4號生理小種。

將東農L-10種子在蛭石+草炭土（1∶1）中萌發，萌發后移栽至裝滿蒸氣殺菌砂盆中。將苗期幼苗放入生長室水桶。大豆在自然光周期生長室中培養，采用隨機完全區組設計，3個重復，每個重復10株。每株幼苗接種約2 000條幼蟲（J2）。分別于接種后0、7 d隨機選擇SCN接種的根，酸性品紅染色，以確認感染成功。采集接種成功根樣，用于轉錄組測序。

選取尺寸一致抗大豆胞囊線蟲病材料和感病材料種子種于蛭石+草炭土（1∶1）中，在溫室中（28℃/25℃、16 h光照/8 h黑暗、相對濕度70%）培養至苗期，幼苗接種約2 000條幼蟲（J2），酸性品紅染色，以確認感染成功。分別于接種后0、3、7、10 d隨機選擇3株SCN接種和未接種大豆根樣，用于基因表達分析。

1.2 大豆總RNA提取和cDNA合成

采用Trizol法提取大豆根系總RNA，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。Nanovue超微量紫外分光光度計檢測純度及濃度。使用SYBR Prime-Script RT-PCR Kit試劑盒反轉錄提取RNA，得到cDNA。

1.3 轉錄組數據分析

將cDNA送往北京華大測序公司作RNA-Seq分析。使用Illumina HiSeq2000平臺產生用于從頭組裝的100 bp成對末端序列讀物。在Illumina HiSeq 2000平臺上，采用50 bp單端讀數對文庫測序，作RNA-Seq分析。根據基因處理前后表達量，篩選脅迫后明顯上調基因。

1.4 基因克隆

通過在線程序Phytozome（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）查找GmPEBP4-1基因序列，利用Primer primier 5.0軟件設計特異引物，引物為GmPEBP4-1F：AGAACACGGGGGACTATGTCTAGGCTCATGGAACC

GmPEBP4-1R：ATCCTCTGTTTCTAGTCACCT CCTTCTTGCAGCAG，以東農L-10 cDNA為模板作特異性擴增。PCR擴增體系20 μL，DNA模板1 μL、10×PCR butter 2 μL、2.5 mmol·L-1dNTP mix 0.2 μL、引物 F 0.5 μL、引物 R 0.5 μL、Taq酶0.3 μL、ddH2O 15.5 μL。PCR反應程序為：預變性94℃，5 min；變性94℃，10 s；退火60℃，30 s；延伸溫度：72℃，30 s，共36個循環，4℃保存。將所擴增片段連接pMD18-T載體后轉化大腸桿菌感受態DH5ɑ，挑取陽性克隆送至北京華大公司測序，利用DNAMAN軟件比對測序結果。

1.5 生物信息學分析

利用在線程序ProtParam（http://web.expasy.org/prot-param/）分析GmPEBP4-1蛋白理化性質；利用在線軟件ExPASy-ProtScale（http://www.Expasy.org/tools/protscale.html）預測編碼蛋白疏水性/親水性；利用在線軟件NCBI CDD（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/docs/cdd_search.html）分析蛋白結構域；利用在線程序SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）預測蛋白二級結構；利用MEGA7軟件構建系統發育樹，采取遺傳距離建樹相鄰連接法；通過大豆基因數據庫Phtozome（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html），選取候選基因上游2 000 bp分析啟動子，并在Plant CARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在線分析軟件上分析基因啟動子順式作用元件。

1.6 GmPEBP4-1基因表達分析

GmPEBP4-1基因序列，利用Primer primier 5.0軟件設計實時熒光定量PCR引物，引物為F：TTCGATCCCTTCACTTTGC，R：AGGACTTGGAGCATC TGGG。內參基因選取大豆管家基因Actin 4，引物序列為Actin 4F：GTTTCAAGCTCTTGCTCGTAATCA，Actin 4R：GTGTCAGCCATACTGTCCCCATTT。應用Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System（Life technologies，USA），以4個時間點處理和對照根系cDNA為模板，作qRT-PCR擴增。熒光反應體系參照SYBR?Select Master Mix試劑盒（TaKaRa）說明書，PCR反應體系20 μL，Green Premix Ex TaqTMII（2×）10 μL，上游引物（10 ng·mL-1）0.8 μL，下游引物（10 ng·mL-1）0.8 μL，，模板2 μL， ddH2O 6.4 μL。 反 應程 序 ：95 ℃ 30 s，95℃3 s，60℃30 s，72℃30 s，40個循環。采用2-ΔΔCT法計算基因相對表達量[14]，設置3次獨立技術重復和3次生物學重復。

2 結果與分析

2.1 GmPEBP4-1基因序列克隆及生物信息學分析

選取在蛭石中培養15 d后東農L-10根部組織提取總RNA，經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，18S和28S帶型清晰（見圖1），無明顯降解，利用Nanovue超微量紫外分光光度計檢測提取RNA，OD260/280均在1.96～2.1，表明提取RNA完整性好，純度較高，可用于反轉錄。

以反轉錄后cDNA為模板，利用GmPEBP4-1克隆引物對其作PCR擴增，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖2，GmPEBP4-1基因擴增片段長度為500 bp左右，與預期519 bp一致，將PCR擴增產物測序比對，結果見圖3，與參考序列相同，證明PCR擴增結果正確。

通過ExPASy-ProParam分析GmPEBP4-1（Glycine max Wm82.a2.v1）基因序列編碼蛋白質理化性質，結果表明，GmPEBP4-1編碼172個氨基酸，ExPASy-ProParam蛋白分子質量為19.34 ku，原子總數為2 716個，化學式為C854H1358N246O249S9，不穩定指數（Instability index，II）52.58（大于40.0），是一種不穩定蛋白，脂肪系數76.98，總平均親水性-0.337。進一步分析氨基酸組分顯示（見圖4），精氨酸（Arg）、脯氨酸（Pro）和纈氨酸（Val）占比最高，等電點為9.16，含有19個負電荷氨基酸殘基（Asp+Glu）和22個正電荷氨基酸殘基（Arg+Lys），預測為酸性蛋白。通過在線工具ExPASy-ProScale預測分析編碼蛋白疏水性（見圖5），GmPEBP4-1蛋白在126-149位氨基酸有最強親水性，其在第141位處有最強親水峰值-3.189；在第14-29位氨基酸區域有較強疏水性，其中第155處有最大疏水性峰值1.911。親水性氨基酸多于疏水性氨基酸，屬于親水性蛋白。通過NCBI CDD（Conserved Protein Domain Family）分析GmPEBP4-1蛋白保守結構域（見圖6），該基因保守結構域為磷脂酰乙醇胺結合蛋白（PEBP，PF01161）結構域，存在8個底物結合位點。對該基因蛋白質二級結構預測得到其TM螺旋長度主要存在4種結構（見圖7），分別為16.28% α-螺旋（Alpha helix，Hh）、25.58%延伸鏈結構（Extended strand，E）、4.07%β-轉角結構（Beta turn）及54.07%無規則卷曲結構（Random coil）。從NCBI數據庫中選取與大豆GmPEBP4-1蛋白相似性較高的8種蛋白氨基酸序列，構建系統進化樹，根據不同物種親緣遠近可分為兩組（見圖8），大豆（Glycine max）、相思子（Abrus precatorius）、胡桃（Juglans regia）、樹棉（Gossypium arboreum）、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）、番木瓜（Carica papaya）、菜豆（Phaseolus vulgaris）聚為一組，擬南芥（Arabidopsis thaliala）、長蒴黃麻（Corchorus olitorius）聚為一組。兩個分組中，大豆GmPEBP4-1蛋白與相思子PEBP蛋白親緣性最高。

從大豆基因組數據庫（Phytozome）中搜索到GmPEBP4-1基因序列，截取ATG上游2 000 bp序列，輸入Plant CARE在線分析系統中分析啟動子發現，該基因上游存在35種順式作用元件，其中CGTCA-motif、TGACG-motif為控制茉莉酸甲酯（MEJA）順式作用元件，在響應生物和非生物脅迫中發揮重要作用；TCT-rich repeats，P-box和ABRE為應激、脅迫響應相關元件（見圖9），推測該基因可感知逆境脅迫并參與抗逆變化。

2.2 GmPEBP4-1基因表達分析

為進一步驗證大豆GmPEBP4-1基因是否在抗病過程中發揮作用，在大豆胞囊線蟲4號生理小種侵染不同階段，利用qRT-PCR分析該基因在抗病材料東農L-10、東農L-204、Kangxian2和感病材料黑農37、綏農14、綏農10表達量。由圖10可知，抗病品種在大豆胞囊線蟲脅迫后3、7、10 d，GmPEBP4-1基因表達量較對照均顯著提高，表現先升后降趨勢，并在7 d時表達量最高。在感病品種黑農37中，大豆胞囊線蟲脅迫7 d時GmPEBP4-1基因表達量最高，3和10 d時Gm-PEBP4-1基因表達量較對照變化不顯著。由結果可知，GmPEBP4-1基因在大豆胞囊線蟲4號生理小種脅迫過程存在響應，但在抗病品種和感病品種中基因表達模式存在差異。

3 討論與結論

本研究利用抗病材料東農L-10轉錄組測序結果，篩選出受大豆胞囊線蟲4號生理小種脅迫差異表達基因GmPEBP4-1。利用RT-PCR技術成功克隆GmPEBP4-1基因，經生物信息學軟件分析發現，該基因CDS序列全長519 bp，編碼172個氨基酸，是一種親水性蛋白。氨基酸組分中精氨酸（Arg）、脯氨酸（Pro）和纈氨酸（Val）占比最高；等電點為9.16，初步預測為酸性蛋白。其編碼的蛋白質含有無規則卷曲（54.07%）、延伸鏈（25.58%）、α-螺旋（16.28%）和β-轉角（4.07%）。系統進化樹分析表明，大豆GmPEBP4-1蛋白與相思子PEBP蛋白同源性最高，親緣性最近。GmPEBP4-1蛋白保守結構域分析顯示含有保守PEBP（PF01161）結構域，與張禮鳳等[15]大豆PEBP基因家族均具有保守PEBP結構域研究結果一致。

啟動子順式作用元件為同一DNA分子中具有特殊功能的轉錄因子DNA結合位點和其他調控基序，在基因轉錄起始調控中發揮重要作用；本研究通過PlantCARE在線預測軟件分析GmPEBP4-1基因上游2 000 bp序列啟動子元件，發現該基因上游存在（TCT-rich repeats，P-box、ABRE）與應激、脅迫相關元件。表明該基因可感知逆境脅迫并參與抗逆變化，與劉瑞芬等磷脂酰乙醇胺結合蛋白基因與小麥抗寒能力研究結果一致[16]。同時在該基因啟動子中還發現（CGTCA-motif、TGACG-motif）控制茉莉酸甲酯（MEJA）順式作用元件，表明利用葉面噴施茉莉酸有效降低線蟲在易感番茄中繁殖能力，提高防御能力[17]；在茉莉酸處理條件下，可提高溫度敏感的抗線蟲基因在高溫處理下抗性[18]；大豆防御SCN侵染反應中，茉莉酸部分合成途徑在植物防御系統中表現為上調[19]；在大豆中過表達參與茉莉酸類JA/JA-Ile途徑3個擬南芥基因（AtAOS、AtAOC和AtJAR），提高其SCN抗性[9]。在水稻抗根結線蟲研究中發現，外施茉莉酸甲酯（MeJA）導致線蟲跟植物互作活力降低，植物抗性增強[20]；這些結果說明茉莉酸作為一種內源生長調節物質，參與抗線蟲反應。因此，存在茉莉酸甲酯（MEJA）順式作用元件的GmPEBP4-1基因可能在抗大豆胞囊線蟲反應中發揮作用。

當植物受外界脅迫時，防衛基因可被多種因子誘導，引起新基因表達和原有基因活化，抵御外界脅迫[21]。本研究中，在大豆胞囊線蟲4號生理小種脅迫下，利用qRT-PCR分析抗病品種東農L-10、東農L204、Kangxian2和感病品種黑農37、綏農14、綏農10中GmPEBP4-1基因表達量，結果表明GmPEBP4-1基因在大豆胞囊線蟲4號生理小種脅迫下存在響應，并在抗感品種中表達量存在顯著差異。東農L-10、東農L-204和Kangxian2不但具有大豆胞囊線蟲4號生理小種抗性，也具有大豆胞囊線蟲3號生理小種抗性，所以推測Gm-PEBP4-1基因可能對大豆胞囊線蟲3號生理小種存在響應。Klink等研究表明SCN在侵染大豆后8 d左右開始建立合胞體[22]，本研究中抗病品種和感病品種GmPEBP4-1基因表達量均在7 d達到最大值，表明該基因可能在大豆胞囊線蟲大豆體內建立合胞體時發揮重要作用。

本研究初步確定GmPEBP4-1基因響應大豆胞囊線蟲4號生理小種，預測GmPEBP4-1基因生物信息學功能，但GmPEBP4-1基因在大豆中是否提高SCN抗性以及具體功能有待進一步研究。本研究結果為進一步探究GmPEBP4-1基因功能及其參與大豆胞囊線蟲病基因相關分子機制奠定理論依據。