蘋果屬小金海棠WRKY48基因克隆與功能初步分析

韓德果，周正一，杜 漫，李鐵梅，王 爽，楊國慧

（東北農業大學園藝園林學院，農業農村部東北地區園藝作物生物學與種質創制重點實驗室，哈爾濱 150030）

鐵是植物生命活動必需元素，在植物生理上發揮重要作用[1]。在葉綠素形成過程中十分重要，缺鐵導致葉綠素解體乃至葉片嚴重失綠。另外，鐵是一些關鍵氧化還原酶（如SOD、CAT和POD等）組分，位于血紅蛋白電子轉移鍵上的鐵在催化氧化還原反應中可變成氧化態或還原態，即減少或增加一個電子，是植物生理反應中重要的電子傳遞體[2]。鐵元素作為鐵蛋白組成部分，在光合作用、呼吸作用等過程中均發揮極為重要作用。植物在缺鐵或高鐵環境中形成一種自我保護機制抵御鐵脅迫危害，轉錄因子則在這一機制中發揮關鍵作用[3]。轉錄因子（Transacting factor，TF）可單獨或與其他相關蛋白形成復合體，以序列特異性結合方式與啟動子區域中DNA序列結合調節轉錄，調控植物生長發育及植株對各脅迫應答反應[4]。

WRKY類轉錄因子作為植物轉錄因子家族重要分支，其氨基酸序列中均有1～2個保守WRKY結構域（氨基酸殘基為WRKYGQK），WRKY的DNA結合域一般包含一個鋅指結構域（C-X4-5-CX22-23-H-X1-H或 C-X7-C-X23-H-X1-C）[5]。WRKY調控因子僅存在于植物中，與下游基因啟動子特異性結合，調控下游基因表達強度[6]。研究證實，模式植物擬南芥中有75個WRKY轉錄因子[7]，而禾本科作物水稻中RKY轉錄因子有109個[8]。在轉基因擬南芥中過表達甘薯IbWRKY2基因提高轉基因擬南芥在鹽脅迫和干旱脅迫下體內脯氨酸含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性，并使轉基因擬南芥耐旱性和耐鹽性增強[9]。在水稻中發現一種新ABA信號抑制因子OsWRKY29，通過直接下調OsABF1和OsVP1表達抑制種子休眠[10]。此外，擬南芥中某些WRKY基因也調控體內水楊酸合成[11]。高溫誘導水稻OsWRKY11基因表達量上調，且過表達試驗證明該基因提高轉基因植株對高溫脅迫耐受性[12]。

關于WRKY報道主要在高溫、高鹽、缺水等逆境脅迫方面，關于鐵脅迫研究較少。小金海棠是蘋果屬中鐵高效基因型植物，其鐵吸收機制遵循機理Ⅰ模式，因在四川省小金縣發現故而得名[13]，近年隨著鐵吸收與轉運機制研究深入，該物種已成為研究蘋果屬植物鐵運輸模式植物[3]。目前已在小金海棠中克隆并研究多種耐鐵脅迫基因。小金海棠MxCS1-3基因參與檸檬酸合成酶生成并影響檸檬酸含量，而轉化MxCS1-3基因植株對鐵脅迫耐受性顯著上調[1,3]。小金海棠MxNAS1-2基因受鐵脅迫表達上調，轉MxNAS1-2基因明顯提高植株耐鐵脅迫能力[2]。因此以小金海棠為試驗材料研究WRKY轉錄因子在鐵脅迫過程中作用機制具有重要意義。

本試驗從小金海棠中分離得到一個WRKY家族基因，命名為MxWRKY48，借助農桿菌侵染法將MxWRKY48轉化至模式植物擬南芥，通過測定模式植物各項生理指標分析和鑒定其功能，從分子育種角度選育鐵脅迫抗性強新品種，為今后研究提供分子基礎和新備選基因。

1 材料與方法

1.1 材料

根據Han等方法[1]，將蘋果屬小金海棠組培苗在MS培養基上快速生長。待幼苗長至5 cm時，剪去小金海棠幼苗莖底部愈傷組織和底部多余葉片，僅留頂部3片葉，接種于1.0 mg·L-1IBA的MS生根培養基，培養40 d，至幼苗長出根系，挑選根系強壯小金海棠無菌苗轉至霍格蘭氏（Hoagland）培養液中再生長約35 d，幼苗10 cm時取材和脅迫處理。

提取RNA試劑盒為OminiPlant RNA Kit（DN-ase I）試劑盒，膠回收試劑盒使用Gel Extraction Kit，均購自康為世紀生物科技有限公司。cDNA第一鏈合成使用Trans Script?First-Strand cDNA Synthesis Super Mix試劑盒、Trans-T1感受態細胞和基因克隆試劑盒pEASY-T1 Simple Cloning Kit均購于北京全式金生物技術有限公司。擴增引物與菌液測序均由北京擎科生物科技有限公司完成。實時熒光定量PCR分析采用TB Green?Premix ExTaq? II（Tli RNaseH Plus）試劑盒，購自寶日醫生物技術（北京）有限公司。農桿菌感受態選用GV3101，購自上海唯地生物技術有限公司。

1.2 MxWRKY48基因克隆

參考蘋果屬金冠MdWRKY48基因組序列，利用Primer 5.0軟件設計特異性引物MxWRKY48-F和MxWRKY48-R（見表1）擴增MxWRKY48基因全長序列。CATB法提取小金海棠各部位總RNA[3]，Script?First-Strand cDNA Synthesis Super Mix試劑盒合成第一鏈cDNA。然后以該cDNA為模板作PCR反應。膠回收目的條帶，將膠回收產物連接到pEASY-T1載體上，轉化Trans-T1感受態細胞后對陽性菌落挑菌測序。

表1 研究所用引物序列Table 1 Primers used in the study

1.3 MxWRKY48生物信息學分析

DNAMAN 6.0翻譯克隆得到MxWRKY48基因序列，使用ProtParam tool預測MxWRKY48總平均親水系數、相對分子質量和理論等電點。利用NCBI的blast查找同源蛋白序列，再用DNAMAN 6.0比對同源蛋白，MEGA 7.0分析WRKY家族成員同源性。

1.4 MxWRKY48蛋白亞細胞定位

亞細胞定位方法參照宋毓峰等方法[14]。以反轉錄得到cDNA為模板，以MxWRKY48-F2和Mx-WRKY48-R2為引物，PCR擴增MxWRKY48基因ORF。使用BamH I和SalI酶將PCR產物雙酶切，將酶切后產物連入含綠色熒光蛋白（GFP）的pSAT6-RFP-N1載體BamHⅠ和SalⅠ酶切位點。以空載體為對照，通過基因槍法將含MxWRKY48-GFP質粒和對照質粒分別導入洋蔥表皮細胞。使用共聚焦顯微鏡拍攝MxWRKY48-GFP融合和對照蛋白，4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色細胞核觀察并拍照。

1.5 MxWRKY48在不同組織及處理中表達模式分析

1.5.1 組織特異性分析

在25℃條件下，分別取未處理小金海棠水培苗莖、新葉、根和老葉材料，立即液氮冷凍，-80℃冰箱備用。提取上述材料RNA反轉錄，作實時熒光定量PCR（qPCR），分析其不同部位表達情況。

1.5.2 高鐵、低鐵、低溫及鹽脅迫處理

從培養好小金海棠水培苗中各取20株轉移至不同Fe濃度4 μmol·L-1（低鐵）、40 μmol·L-1（正常）和 160 μmol·L-1（高鐵）霍格蘭氏營養液中培養24 h；將其中20株培養在高鹽（200 mmol·L-1NaCl）霍格蘭氏培養液中處理24 h；取20株在低溫（2℃）霍格蘭氏營養液處理24 h。分別在處理第0、1、3、6、9、12、24 h時試驗材料水培苗根和新葉取材。上述材料液氮速凍后置于-80℃冰箱備用。CATB法提取RNA并反轉錄，Primer 5.0設計引物MxWRKY48-qF和MxWRKY48-qR（見表1），作qPCR，分析該基因定量表達情況。

1.5.3 數據分析與處理

內參選用Actin基因，設計引物Actin-F和Actin-R（見表1）。利用實時定量PCR和2-ΔΔCT法計算分析目的基因表達量，試驗設置3次重復。

1.6 擬南芥轉化和篩選

為構建擬南芥超表達載體，通過PCR程序將BamHⅠ和SalⅠ酶切位點序列分別添加到Mx-WRKY48的cDNA 5'和3'端。將pCAMBIA2300質粒用限制性內切酶BamHⅠ和SalⅠ酶切，使用同源重組試劑盒（諾唯贊公司）將PCR產物與酶切后質粒連接獲得pCAMBIA2300-MxWRKY48過表達載體，之后將其轉入GV3101。利用花序浸染法侵染野生型擬南芥獲得T0代轉基因植株。收取T0代成熟種子后將其播種在含50 mg·L-1Kana的MS篩選培養基中，選取長至2片真葉陽性植株轉移至營養土（營養土∶蛭石=3∶1）中培養，提取轉基因擬南芥葉片DNA，選取兩對引物Actin-F、Actin-R和Mx-WRKY48-F和MxWRKY48-R作PCR檢測，收獲驗證為陽性種子。后繼續培養直至收獲T3代植株。

1.7 轉MxWRKY48擬南芥耐低鐵和高鐵脅迫性分析

將野生型擬南芥種子和隨機選取篩選好的S1、S4和S6 3個T3代轉MxWRKY48株系種子消毒后播種于MS培養基，待其長出4片真葉后，將這4個株系擬南芥植株均各取30株轉移至FeNa-EDTA濃度為4 μmol·L-（1低鐵水平）、100 μmol·L-1（正常鐵水平）、400 μmol·L-（1高鐵水平），其他濃度正常MS培養基上生長。第14天時對各株系拍照，測量植株主根長和鮮重，參照袁方等[15]和Liu等[16]方法分別測定葉片葉綠素和鐵元素含量。

2 結果與分析

2.1 MxWRKY48基因序列分析

MxWRKY48基因ORF為1 116 bp。MxWRKY48蛋白含371個氨基酸，分子質量約為41.143 ku，理論等電點約為5.80，平均親水系數為-0.852。DNAMAN 6.0序列分析顯示MxWRKY48氨基酸序列中包含1個鋅指結構C2H2（C-X4-C-X22-H-X-H）和1個WRKY結構域，由此應將MxWRKY48歸于II-c類。

2.2 MxWRKY48同源蛋白分析

DNAMAN 6.0多重序列比對結果如圖1A所示。圖中各序列均含有1個WRKY結構域和1個C2H2類型鋅指結構。如圖1B所示，系統進化樹分析表明，MxWRKY48屬于WRKYs家族成員，MxWRKY48蛋白與蘋果屬金冠MdWRKY48親緣關系最近。

2.3 MxWRKY48蛋白亞細胞定位

在轉化MxWRKY48-GFP蛋白洋蔥表皮細胞時僅在細胞核上觀察到綠色熒光（見圖2E），而轉化GFP對照質粒則可在洋蔥表皮細胞各部位觀察到綠色熒光（見圖2B）。同時DAPI染色照片藍色熒光確定細胞核位置與綠色熒光位置相同（見圖2C、F），因此判斷MxWRKY48定位在細胞核上。

2.4 MxWRKY48表達模式分析

利用qPCR測定小金海棠不同部位MxWRKY48基因表達水平。如圖3A所示，在新葉中MxWRKY48基因表達量顯著高于根、成熟葉和莖中。如圖3B所示，在不同脅迫處理下，MxWRKY48在根中表達量均隨時間增加而呈上調趨勢。在低溫脅迫下，根中MxWRKY48基因表達量在3 h時開始迅速增加，在6 h時上升至最高值，之后逐漸降低；在鹽脅迫下，根中MxWRKY48基因表達量在3 h時開始顯著增加，9 h時表達量升至最高，接下來呈下降趨勢；在低鐵脅迫下，根中MxWRKY48基因表達量在1 h時開始迅速增加，6 h時表達量最高，后呈下降趨勢；在高鐵脅迫下，根中MxWRKY48基因表達量在3 h時升高，9 h時達最高，隨后開始下降。如圖3C所示，在低溫處理時，MxWRKY48基因在葉中表達量在初期（1 h）升高，在3 h時達極值，是未處理時8倍，隨后逐步下降；在鹽、低鐵、高鐵處理時，該基因在葉中表達變化呈相似趨勢，9 h時達極值，其表達量分別為0 h時6.5、7.5、6.8倍。以上數據顯示，低鐵、高鐵、低溫和鹽處理均使Mx-WRKY48在該蘋果屬材料根和葉中顯著上調表達。

2.5 轉化MxWRKY48基因增強轉基因擬南芥對低鐵和高鐵脅迫耐受能力

利用花序侵染法轉MxWRKY48基因擬南芥，T1代轉基因擬南芥鑒定結果顯示（見圖4A）在15個轉基因擬南芥株系中有6個株系（S1、S4、S5、S6、S14、S15）確定為轉基因擬南芥，隨機挑選S1、S4、S6株系開展脅迫試驗。如圖4B所示，正常鐵水平處理時（100 μmol·L-1Fe），野生型株系WT和轉MxWRKY48株系（S1、S4、S6）間無明顯差異，株系均可正常生長。但在缺鐵處理（4 μmol·L-1Fe）下生長14 d后，野生型擬南芥葉片明顯黃化失綠，出現典型枯黃萎病癥狀，且長勢較弱。而轉基因擬南芥株系（S1、S4、S6）生長狀態顯著優于野生型擬南芥WT。在高鐵濃度（400 μmol·L-1Fe）處理14 d后，野生型擬南芥植株葉片縮小出現高鐵毒害癥狀且根部短小，而轉基因植株葉片仍呈深綠色，生長狀態較好。

為確定低鐵和高鐵脅迫對不同植株生長狀況，測定野生型株系WT和轉MxWRKY48基因型株系（S1、S4、S6）葉片葉綠素含量、主根長度、植株鮮重和鐵含量。如圖5A所示，正常Fe濃度下，轉擬南芥和野生型擬南芥葉片中葉綠素含量處于同一水平。低鐵處理轉基因擬南芥與野生型14 d后，同對照處理相比，兩者葉片葉綠素含量均顯著降低，但轉MxWRKY48基因擬南芥葉片中葉綠素減少量低于野生型擬南芥葉片；高鐵處理野生型擬南芥與轉MxWRKY48基因擬南芥14 d后，同對照處理相比，兩者葉綠素含量分別下降52%和37%，此時轉基因植株葉綠素下降量少于野生型擬南芥。說明MxWRKY48基因在轉基因擬南芥中過表達使植株在受低鐵和高鐵脅迫時，減少體內葉綠素分解。如圖5B所示，在正常處理14 d后，轉MxWRKY48株系（S1、S4、S6）和野生型擬南芥根長度無顯著差異。低鐵和高鐵處理14 d后，轉MxWRKY48株系（S1、S4、S6）根長均顯著高于野生型株系。

如圖5C所示，對照條件下，轉MxWRKY48基因擬南芥和野生型擬南芥中鐵含量無顯著差異。低鐵處理14 d后，野生型擬南芥和轉基因擬南芥鐵含量均受到影響，與對照處理相比分別下降43%和16%，此時野生型擬南芥鐵含量低于轉基因擬南芥；高鐵處理14 d后，野生型擬南芥和轉基因擬南芥鐵含量分別升高42%和71%，此時轉基因擬南芥鐵元素含量仍高于野生型擬南芥。如圖5D所示，在正常處理14 d后，轉MxWRKY48株系（S1、S4、S6）和野生型擬南芥鮮重無顯著差異。低鐵和高鐵處理14 d后，轉MxWRKY48株系（S1、S4、S6）鮮重均顯著高于野生型株系。以上結果表明，MxWRKY48基因在轉基因擬南芥中表達導致在低鐵和高鐵脅迫下植株、葉綠素含量、主根長度、鮮重和鐵含量增加，提高抵抗低鐵和高鐵脅迫能力。

3 討論與結論

WRKY轉錄因子在植物中廣泛存在，近年來在大豆[17]、水稻[18]、玉米[19]等植物出現相關報道。研究結果表明，WRKY在廣泛參與植物應對生物和非生物脅迫等生理生化反應過程調控過程[20]。主要集中在禾本科植物抗鹽和低溫脅迫等方面，關于果樹抗鐵脅迫方面研究報道較少。

本試驗在小金海棠中克隆得到一條與金冠蘋果MdWRKY48基因相似性較高WRKY基因，命名為MdWRKY48。DNAMAN 6.0序列分析顯示Md-WRKY48氨基酸序列和選取的其他13種氨基酸序列均含有一個WRKY結構域和一個C2H2（C-X4-CX22-H-X-H）型鋅指結構，可將其歸類為WRKY基因家族中第II類基因。同源進化樹也表明Mx-WRKY48屬于WRKY基因家族，與MdWRKY48相似性最高。研究表明，AtWRKY61[21]、CsWRKY50[22]、Sc-WRKY6[23]及GhWRKY40[24]均定位于細胞核。洋蔥亞細胞定位試驗結果表明MxWRKY48蛋白定位于細胞核，與前人研究結果一致，以上結果表明Mx-WRKY48基因是WRKYs基因家族成員。

熒光定量PCR結果顯示MxWRKY48基因在蘋果屬小金海棠各部位均表達，在新葉中表達豐度高于根、成熟葉和莖，表明MxWRKY48可能在生理功能活躍的植物器官中發揮重要作用。在4種脅迫處理下，MxWRKY48在小金海棠新葉和根中表達量均呈初期增加，達到最大值后逐漸降低趨勢。在低鐵和高鐵脅迫處理時，MxWRKY48基因在根中表達量分別于6和9 h達最大值，顯著早于新葉中達到最大值時間（12 h），表明鐵脅迫時MxWRKY48基因首先在根中響應，之后傳遞到葉中。對于Mx-WRKY48基因表達來說，鹽脅迫信號首先在根中響應，再傳遞到葉；而低溫脅迫首先在葉中響應，再傳遞到根。以上結果表明MxWRKY48基因可能廣泛參與蘋果屬小金海棠抵抗高鐵、低鐵、低溫和鹽脅迫信號傳導過程。因為鐵脅迫處理，特別是低鐵脅迫處理對MxWRKY48基因表達量影響最顯著，達極值時間最早，因此本試驗著重研究Mx-WRKY48基因在鐵脅迫方面功能。

擬南芥轉化試驗結果顯示，MxWRKY48基因在擬南芥中過表達顯著提高植株對高鐵和低鐵脅迫抵抗能力。在低鐵處理下，轉MxWRKY48基因擬南芥葉片黃化現象不明顯，而野生型擬南芥葉片失綠，出現明顯黃化。此時轉MxWRKY48基因擬南芥主根長度、鮮重、葉片中葉綠素和鐵含量均顯著高于野生型擬南芥。表明MxWRKY48基因在轉基因擬南芥中超表達提高擬南芥對低鐵脅迫抵抗能力。在高鐵脅迫下，轉基因擬南芥葉片黃化現象較輕；而野生型擬南芥葉片失綠變紫，生長情況嚴重受阻。同時轉MxWRKY48基因擬南芥葉片中葉綠素和鐵含量也顯著高于野生型擬南芥（見圖4、5）。表明在低鐵和高鐵脅迫時，轉基因擬南芥中MxWRKY48基因過表達促進體內鐵轉運，減少葉綠素分解，從而增強植株對低鐵和高鐵脅迫耐受性。