UBQLN-1和RUNX3在直腸癌組織中的表達和臨床意義

孫光源 郭圣超 武雪亮 薛軍 屈明 郭飛 韓磊 韓潔

[摘要] 目的 探討UBQLN-1（泛素-1）和人Runt相關轉錄因子3（RUNX3）在直腸癌組織中的表達和臨床意義。方法 選取2017年6月—2019年6月河北北方學院附屬第一醫院行手術切除的85例直腸癌組織和相應癌旁正常組織，應用逆轉錄聚合酶鏈反應法（RT-PCR）和免疫組化法檢測UBQLN-1及RUNX3 mRNA與蛋白水平，分析其與腫瘤臨床病理特征間的關系及二者表達的相關性。 結果 直腸癌組織中UBQLN-1 mRNA表達水平高于癌旁正常組織，RUNX3 mRNA的表達水平低于癌旁正常組織，差異均有高度統計學（P < 0.01）。直腸癌組織中UBQLN-1陽性表達率高于癌旁正常組織，RUNX3陽性表達率低于癌旁正常組織，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。直腸癌組織中UBQLN-1與RUNX3表達呈負相關（r = -0.225，P = 0.038）。 結論 UBQLN-1和RUNX3在直腸癌組織中的異常表達與其發生發展、演進密切相關，且二者呈明顯負相關，可作為直腸癌診斷、治療和預后評估的潛在分子生物學指標。

[關鍵詞] 泛素-1;人Runt相關轉錄因子3;直腸癌;臨床意義

[中圖分類號] R735.3+7? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）09（c）-0028-05

Expression of UBQLN-1 and RUNX3 in rectal cancer tissues and their clinical significance

SUN Guangyuan1? ?GUO Shengchao2? ?WU Xueliang1? ?XUE Jun1? ?QU Ming1? ?GUO Fei1? ?HAN Lei1? ?HAN Jie3

1.Department of General Surgery， the First Affiliated Hospital of Hebei North University， Hebei Province， Zhangjiakou? ?075061， China; 2.Graduate School， Hebei North University， Hebei Province， Zhangjiakou? ?075061， China; 3.Department of Ophtalmology， the Fourth Hospital of Zhangjiakou， Hebei Province， Zhangjiakou? ?075061， China

[Abstract] Objective To explore the expression of UBQLN-1 and RUNX3 in rectal cancer tissues and clinical significance. Methods From June 2017 to June 2019， 85 cases of rectal cancer tissues and adjacent normal tissues were selected from the First Affiliated Hospital of Hebei North University were selected. The mRNA and protein levels of UBQLN-1 and RUNX3 were detected by reverse transcription polymerase chain reaction （RT-PCR） and immunohistochemistry and the relationship between UBQLN-1， RUNX3 and the clinicopathological characteristics of tumors and the correlation between their expressions were analyzed. Results The expression of UBQLN-1 mRNA in rectal cancer tissues was higher than that in adjacent normal tissues; and the expression of RUNX3 mRNA in rectal cancer tissues was lower than that in adjacent normal tissues，and the differences were highly statistically significant （P < 0.01）. The positive expression rate of UBQLN-1 in rectal cancer tissues was higher than that in adjacent normal tissues and the positive expression rate of RUNX3 was lower than that of adjacent normal tissues， with highly statistically significant differences （P < 0.01）. UBQLN-1 was negatively correlated with RUNX3 expression in rectal cancer tissues（r = -0.225， P = 0.038）. Conclusion The abnormal expressions of UBQLN-1 and RUNX3 in the rectal cancer tissues are closely related to their development and evolution， and rectal cancer tissues and adjacent normal tissues are significantly negatively correlated， which can be used as potential molecular biological indicators for the diagnosis， treatment and prognosis assessment of rectal cancer.

[Key words] Ubiquitin-1; Human RUNt-related transcription factor 3; Rectal cancer; Clinical significance

2018年全球癌癥流行病學數據庫顯示[1]，全球結直腸癌新增病例180萬例，占新發癌癥病例總數的10.2%，居惡性腫瘤第三位，結直腸癌死亡病例達80萬，占癌癥死亡總數的9.2%，惡性腫瘤排名第二。2015年我國結直腸癌新發病例約為38.80萬例，發病率位居第三位，死亡病例約為18.7萬例，死亡率位居第五位，防控診療形勢不容樂觀[2]

泛素-1（UBQLN-1）屬于泛素樣蛋白一族，在調節蛋白質降解中起重要作用。UBQLN-1功能的失活可誘導人類多種神經退行性疾病的病理過程，如阿爾茨海默病和亨廷頓病等[3-5]。此外，最新研究顯示[6]，UBQLN-1與人類乳腺癌、胃癌、非小細胞癌等多種腫瘤的發生和進展有關，但UBQLN-1在結直腸癌中的表達及相應的作用機制尚未見報道。人Runt相關轉錄因子3（RUNX3）是目前研究較熱的一種抑癌基因，本研究之前已證實RUNX3蛋白陽性表達在結直腸癌組織中明顯低于正常組織[7]，但聯合UBQLN1和RUNX3與直腸腫瘤的相關性及其預后的研究尚未見報道。

本研究通過對直腸癌組織行逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）法和免疫組化SP法檢測，旨在探討UBQLN-1和RUNX3在直腸癌中的表達情況及與相關臨床病理特征之間的關系，為直腸癌的早期篩查診斷和預后監測提供潛在可靠的分子生物學指標。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年6月—2019年6月河北北方學院附屬第一醫院（以下簡稱“我院”）行手術切除的85例直腸癌組織和相應癌旁正常組織。納入標準：①相關檢查診斷明確為直腸癌;②肝腎功能正常;③首次治療。排除標準：①不配合治療者;②臨床資料不完整者;③合并其他系統惡性腫瘤及并發癥者。其中男59例，女26例;年齡30～72歲，平均（51.2±7.7）歲;癌胚抗原（CEA）≤5 μg/L 74例，CEA>5 μg/L 11例;糖類抗原（CA）199≤37 U/mL 79例，CA199>37 U/mL 6例;cT分期T1～2、T3～4分別為32、53例;cN分期N-和N+分別為50、35例;臨床病理分期[國際抗癌聯盟UICC結直腸癌TNM分期系統（2018年第八版）[8]]cTNM分期：Ⅱ期50例，Ⅲ期35例;分化程度：低分化17例，中分化66例，高分化2例。本研究經我院醫學倫理委員會批準，患者及家屬知情同意。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑? 反轉錄試劑盒購于中國大連TaKaRa公司（貨號：639505）;引物購于中國廣州鼎國生物科技有限公司;RIPA試劑購于上?；巧锟萍加邢薰荆ㄘ浱枺篜P1901）;鼠抗UBQLN-1（貨號：ab128011）、RUNX3（貨號：ab224641）單克隆抗體購于美國Abcam公司;免疫組化試劑盒（貨號：GK600705）、DAB顯色劑（貨號：GK347010）購于上海Gene Tech公司。

1.2.2 RT-PCR法檢測直腸癌組織和癌旁正常組織UBQLN-1 mRNA和RUNX3 mRNA的表達? 取直腸癌組織和相應癌旁正常組織100 mg，徹底勻漿后按Trizol一步法提取總RNA，測定RNA濃度;設計UBQLN-1上游引物：5′-GGAGACGGTCATCCCTGTAGAT-3′，下游引物：5′-GCTACACTGTACTGGGTCTTTTCCA-3′;RUNX3上游引物：5′-CTCTGCTCTGTCAGCTTCGG-3′，下游引物：5′-AGAATTTGGATTCCCGGTCCC-3′;GAPDH上游引物：5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游引物：5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′;反應體系：1×PCR Buffer 2.5 μL，cDNA模板2 μL，dNTP 0.5 μL，Taq酶1.25 μL，上、下游引物各1 μL，RNA酶抑制劑1 μL，加DEPC-H2O至總體積25 μL。根據試劑盒說明書操作進行擴增，產物經瓊脂電泳后用Labworks 4.5圖像系統分析。

1.2.3 免疫組化檢測直腸癌組織和癌旁正常組織UBQLN-1和RUNX3蛋白的表達? 分別取入組患者手術后的直腸癌組織和癌旁正常組織，4%甲醛溶液固定（固定液用量為組織的10倍），石蠟包埋、連續切片（厚度3 μm/張）。采用免疫組織化學染色SP法對直腸癌組織和癌旁正常組織中UBQLN-1和RUNX3的表達情況進行檢測。將包埋好的石蠟依次進行切片、脫蠟和水化，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3次，3 min/次，抗原修復自然冷卻至室溫，阻斷內源性過氧化物酶，滴加一抗，37℃孵育60 min，PBS液沖洗3次，3 min/次，滴加二抗，室溫孵育10 min，PBS液沖洗3次，3 min/次，滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，室溫孵育10 min，PBS液沖洗3次，3 min/次，DAB顯色，室溫孵育10 min，復染，分化、返藍，脫水、封片，40倍顯微鏡鏡檢并采圖。

UBQLN-1蛋白陽性表達為棕黃色或棕褐色，主要位于細胞質中;RUNX3蛋白在結直腸癌中陽性表達為深棕褐色或棕黃色，主要位于細胞核中，而在正常組織中呈棕黃色顆粒，主要位于細胞漿中，且染色深度遠小于細胞核。兩者的染色評分標準參照文獻[7]的標準：陽性細胞<10%為0分，10%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%～75%為3分，>75%為4分;根據染色強度評分為：無染色0分，弱染色1分，中等染色2分，強染色3分;兩項評分的乘積為最終的評分，總積分≤3分為陰性，>3分為陽性[9]。

1.3 統計學方法

采用SPSS 22.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗;計數資料用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗;相關性采用Pearson相關分析。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 直腸癌組織和癌旁正常組織UBQLN-1 mRNA和RUNX3 mRNA表達比較

直腸癌組織中UBQLN-1 mRNA表達水平（1.28±0.07）高于癌旁正常組織（0.24±0.02），差異有高度統計學意義（t = 131.706，P = 0.000）;直腸癌組織中RUNX3 mRNA的表達水平（0.35±0.04）低于癌旁正常組織（1.20±0.06），差異均有高度統計學（t = 108.674，P = 0.000）。見圖1。

2.2 直腸癌組織和癌旁正常組織UBQLN-1和RUNX3蛋白表達比較

直腸癌組織中UBQLN-1陽性表達率為69.41%（59/85），高于癌旁正常組織的21.18%（18/85），差異有高度統計學意義（χ2=39.906，P = 0.000）;直腸癌組中RUNX3陽性表達率為40.00%（34/85），低于癌旁正常組織的77.65%（66/85），差異有高度統計學意義（χ2=24.869，P = 0.000）。見圖2（封三）。

2.3 直腸癌組織中UBQLN-1和RUNX3表達與患者一般資料及病理特征的關系

UBQLN-1和RUNX3與cT分期、cN分期和cTNM分期及分化程度密切相關（P < 0.05）。見表1。

2.4 直腸癌組織中UBQLN-1與RUNX3表達的相關性

直腸癌組織中UBQLN-1與RUNX3表達呈負相關（r = -0.225，P = 0.038）。

3 討論

UBQLN-1屬于泛素蛋白家族中的核小體表面蛋白，由11個外顯子組成，位于人類染色體9q22，具有高度保守性，包含N端的UBL結構域，它介導泛素與蛋白酶體19S亞基的S5a組分的泛素受體以及C端的Uba相互作用。提示UBQLN-1通過連接泛素化機制和蛋白酶體調節蛋白酶體的降解[10-11]。UBQLN-1在不同的蛋白質降解機制和途徑中發揮重要作用，包括泛素-蛋白酶體系統、自噬和內質網相關蛋白降解（ERAD）途徑。通過與蛋白酶體的多泛素鏈結合以及與蛋白酶體的亞單位相互作用（通過泛素樣結構域）介導蛋白酶體靶向錯誤折疊或積累的蛋白質進行降解[12-13];通過與內質網定位蛋白UBXN4、VCp和HERPUD1的相互作用，在ERAD途徑中發揮作用，并可能在多泛素化的ERAD底物和蛋白酶體之間形成聯系;UBQLN-1是自噬相關蛋白Lc3從胞液形式Lc3-Ⅰ成熟為膜結合型Lc3-Ⅱ所必需的，并可能通過介導自噬小體-溶酶體融合幫助自噬小體成熟為自溶酶體[14]。通過自噬途徑降低TICAM 1的豐度，對TICAM 1/TRIF依賴的Toll樣受體信號通路進行負性調節。

RUNX3基因定位于人類染色體1p36，全長約為67 kb，其表達產物RUNX3蛋白是一種包含415個氨基酸殘基的異二聚體，該基因的沉默、失活導致癌癥的發生[15-16]。研究證實[17-20]，RUNX3主要通過調控轉錄生長因子β（TGF-β）和Wnt信號傳導通路來抑制腫瘤細胞的生長。本團隊前期已證實RUNX3在結直腸癌組織中的表達明顯低于結直腸腺瘤和正常組織，因而RUNX3的失活在結直腸癌變的過程中發揮重要作用[21-25]。此外，Feng等[26]應用基因轉染方法設置直腸癌HRC-9698細胞株的RUNX3過表達組，空白質粒組，陰性對照組和空白組，侵襲實驗顯示RUNX3基因在體外的過度表達能夠抑制直腸癌細胞增殖，阻止細胞的侵襲和轉移，從而為直腸癌的分子靶向治療提供了新思路和新的治療靶標。

本研究結果顯示，UBQLN-1和RUNX3與cT分期、cN分期和cTNM分期及分化程度密切相關（P < 0.05），且UBQLN-1與RUNX3表達呈負相關（r = -0.225，P = 0.038）。目前，尚未有關于二者對術后患者預后方面的文獻報道。

綜上，相較于正常組織，直腸癌組織中UBQLN-1 mRNA與蛋白高表達，RUNX3 mRNA與蛋白低表達，隨著癌組織分化程度變低、cTNM分期變晚，UBQLN-1的陽性表達率升高，而RUNX3的陽性表達率降低，在直腸癌的發生發展中，UBQLN-1的高表達或可調控RUNX3低表達。關于UBQLN-1和RUNX3在結直腸腫瘤領域中的研究目前相對較少，本研究結果顯示UBQLN-1和RUNX3可作為直腸癌早期診斷、預后評估的潛在分子生物學指標，其具體作用機制及二者的相互關系尚需深入研究，這也是本課題今后的研究方向。

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（收稿日期：2020-06-12）