歐當歸內酯A對實驗性纖維化肝臟NO及內皮細胞功能的影響

趙志敏 黃愷 沈麗 劉成海 葉偉成

摘要?目的：探討歐當歸內酯A調節纖維化肝臟NO釋放的抗肝纖維化作用機制。方法：40只Wistar大鼠隨機分為正常組、模型組、歐當歸內酯A 3 mg/kg組、歐當歸內酯A 6 mg/kg組，每組10只。以四氯化碳（CCl4）與高脂低蛋白飲食復合因素誘導肝纖維化模型，連續6周。藥物觀察組于造模第4周腹腔注射給藥至結束。觀察肝組織炎性反應及膠原沉積、eNOS表達及MDA、SOD、NO、NOS水平。體外以800 μmol/L氯化鈷作用于SK-HEP-1細胞24 h誘導細胞缺氧損傷，藥物處理后觀察細胞活力、vWF表達、上清及胞內NO水平。結果：與模型組比較，歐當歸內酯A各組肝細胞變性和炎性反應壞死有所減輕，纖維化改善;高劑量組SOD和MDA顯著改善，NO和NOS降低，eNOS陽性表達下降（P<0.05）。體外實驗顯示，藥物干預后細胞活力得到改善，vWF平均熒光強度減弱，NO釋放顯著改善（P<0.05）。結論：歐當歸內酯A具有抗肝纖維化的作用，其機制可能與抗脂質過氧化損傷，改善內皮細胞功能，調節NO釋放有關。

關鍵詞?肝纖維化;歐當歸內酯A;內皮細胞;一氧化氮;機制

Abstract?Objective：To explore the effects of levistilide A on anti-hepatic fibrosis mechanism of regulating the release of NO from fibrotic liver. Methods：A total of 40 Wistar rats were randomly divided a control group， a model group， a levistilide A 3 mg/kg group and a levistilide 6 mg/kg group， with 10 rats in each group. The liver fibrosis model was induced by a combination of carbon tetrachloride （CCl4） and a high-fat and low-protein diet for 6 consecutive weeks. The drug treatment group was given intraperitoneal injection to the end on the 4th week of modeling. Liver tissue inflammatory reaction and collagen deposition， eNOS expression and MDA， SOD， NO， NOS levels were observed. In vitro， 800 μmol/L cobalt chloride was applied to SK-HEP-1 cells for 24 h to induce cell hypoxia. After drug treatment， cell viability， vWF expression， supernatant and intracellular NO levels were observed. Results：Compared with those in the model group， the degeneration and inflammatory necrosis of Levistilide A in each group were reduced， and the fibrosis was improved; the high-dose group SOD and MDA significantly improved， NO and NOS decreased， and the positive expression of eNOS decreased （P<0.05）. In vitro experiments showed that cell viability was improved after drug intervention， the average fluorescence intensity of vWF was weakened， and the release of NO was significantly improved （P<0.05）. Conclusion：Levistilide A can inhibit liver fibrosis， the mechanism may be related to Levistilide A， anti-lipid peroxidation， and regulate the release of NO.

Keywords?Liver fibrosis; Levistilide A; Endothelial cell; Nitric oxide; Mechanism

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.19.004

肝纖維化存在于大多數慢性肝臟疾病過程中，肝組織內細胞外基質過度增生與沉積導致肝臟組織結構異常改變，并影響肝臟正常生理功能，是慢性肝病過程中一種可逆的肝組織損傷過度修復反應[1]。血管病理改變與纖維化的進展和消退密切相關。內皮細胞損傷、毛細血管化是纖維化發生的早期事件和原因之一。研究表明，NO通路與血管損傷、活化、增殖、功能紊亂等相關且影響纖維化逆轉[2]。歐當歸內酯A具有抗肝纖維化作用，可改善肝竇毛細血管化，但對內皮細胞損傷及功能的作用尚不清楚，本研究通過體內、體外實驗，進一步研究歐當歸內酯A調節纖維化肝臟NO釋放的抗肝纖維化作用機制。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?動物?Wistar大鼠，雄性40只，清潔級，體質量（145±15）g。由中國科學院上海實驗動物中心提供（許可證號：2008001615261，倫理審批號：PZSHUTCM18113012），飼養于上海中醫藥大學動物實驗中心，溫度18～22 ℃，濕度55%～65%，以12/12 h為光暗周期飼養。

1.1.2?細胞?人內皮細胞（SK-HEP-1購自ATCC）為人內皮來源的腹水瘤細胞，具備肝竇內皮的某些特性[3]，常規培養于含10%胎牛血清的MEM培養液，5% CO2及飽和濕度的37 ℃恒溫培養箱中，細胞隔天換液，每2～3 d傳代1次。

1.1.3?藥物?歐當歸內酯A，購自上海融禾醫藥科技發展有限公司，批號：161024，純度：>98%。

1.1.4?試劑與儀器?CCl4（國藥集團化學試劑有限公司，貨號：10006480）、橄欖油溶液（國藥集團化學試劑有限公司，貨號：69018028）、甲醛溶液（國藥化學試劑公司，貨號：10010018）、二甲苯（國藥集團化學試劑有限公司，貨號：10023418）。六水合氯化鈷（CoCl2·6H2O，Sigma公司，美國，貨號：C8661）、甲瓚（MTT）（Sigma公司，美國，貨號：M5655）。MEM干粉（GIBCOTM公司，美國，貨號：1543170）、胎牛血清（Bovogen公司，澳大利亞，貨號：1710B）;DMSO（Amresco公司，美國，貨號：0231）;4%多聚甲醛（北京鼎國生物技術公司，貨號：AR-0211）;NO熒光探針、細胞核染色液（DAPI）、抗兔FITC熒光二抗（碧云天生物技術研究所，貨號：S0019、C1002、P0186）。兔來源血管血友病因子（Von Willebrand Factor，vWF）抗體（Abcam公司，美國，貨號：ab6994）、內皮型一氧化氮合酶（Endothelial nitric oxide synthase，eNOS）抗體（Abcam公司，美國，貨號：ab76198）。移液器（Eppendorf公司，德國，型號：Research plus）;超純水系統（Millipore公司，美國，型號：Direct-Q3）;轉移脫色搖床（海門其林貝爾儀器制造有限公司，型號：TS-8）;高溫高壓滅菌消毒鍋（HIRAYAMA公司，日本，型號：HVE-50）;生物安全柜（青島海爾特種電器有限公司，型號：HR50-IIA2）;微孔板分光光度計（BioTek公司，美國，型號：MQX200R）;倒置顯微鏡（Olympus公司，日本，型號：IX70）;CO2培養箱（Eppendorf公司，德國，型號：Galaxy 170S）、高內涵篩選分析儀（Thermo Scientific有限公司，美國，型號：ArrayScan VTI）。

1.2?方法

1.2.1?分組給藥與動物模型制備?40只大鼠隨機分為4組：正常組、模型組、歐當歸內酯A低劑量組、歐當歸內酯A高劑量組，每組10只。除正常組外，其他各組大鼠均在無菌條件下由皮下注射CCl4，首次劑量為100%CCl4溶液0.5 mL/kg大鼠體質量，后40%CCl4橄欖油溶液（40%CCl4+60%橄欖油）3 mL/kg大鼠體質量，2次/周，連續注射9周。藥物觀察組于造模后第5周開始分別給予歐當歸內酯A高劑量6 mg/（kg·d）、歐當歸內酯A低劑量3 mg/（kg·d）腹腔注射。

1.2.2?取材?實驗結束，于肝組織最大葉切割組織塊3塊，0.5 cm×0.5 cm×0.3 cm大小，其中2塊放入包埋框，4%甲醛溶液固定，脫水、包埋成石蠟組織塊，使用4 μm切片;其余肝組織分裝，-80 ℃保存。肝組織二甲苯、多級乙醇脫蠟至水，進行HE、天狼猩紅和eNOS免疫組化染色。OlympusBX40顯微鏡下100倍、200倍觀察。Image-pro Express6.3軟件攝片，并對天狼猩紅染色片進行半定量分析。

1.2.3?肝組織丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）活性、一氧化氮（Nitric Oxide，NO）含量和一氧化氮合酶（Nitric Oxide Synthase，NOS）活性?肝組織MDA含量采用TBA法測定;SOD活性采用羥胺法測定;肝組織NO含量，采用硝酸還原酶法測定;肝組織NOS活性采用比色法測定。

1.2.4?細胞模型制備及藥物添加?1）細胞模型制備：每孔8 000個細胞接種于96孔板，待細胞密度為70%左右，加入含氯化鈷的培養液（氯化鈷終濃度800 μmol/L），每孔100 μL，設空白對照（0.5%FBS）組，孵育24 h。藥物在80 μmol/L范圍內設6個濃度梯度確定對SK-HEP-1細胞的最大無毒范圍（與不加藥組比存活率>90%），根據最大無毒濃度再分設3個濃度梯度分別作用于細胞模型。各藥物與細胞共孵育24 h同時添加氯化鈷溶液。2）MTT法檢測：細胞接種于96孔板，長至亞單層，棄原培養液，換為各藥物成分培養液，100 μL/孔，4～6個復孔，孵育24 h。棄藥物培養液，加入0.5 mg/mL MTT工作液，孵育4 h?？梢娝{紫色結晶，小心吸棄工作液，加入DMSO 100 μL/孔，至充分溶解，在微孔板掃描分光光度計上測定吸光度OD490。

1.2.5?免疫熒光法?藥物孵育結束后，棄培養液，每孔加入50 μL 4%多聚甲醛室溫固定15 min，PBS洗滌，以0.5% Triton X-100孵育10 min，5%BSA/PBS 37 ℃封閉30 min后加入一抗（抗vWF抗體1∶100，稀釋在3%BSA/PBS中）37 ℃孵育1 h，PBS洗滌后，加入熒光二抗（1∶100，稀釋在3%BSA/PBS中）37 ℃孵育1 h，PBS洗滌后，滴加DAPI染核5 min，PBS洗滌，Cellomics ArrayScan VTI HCS Reader采集圖像，Cellomics Cell Health Profiling BioApplication Software對圖像進行分析。

1.2.6?熒光探針法?細胞接種于96孔板，長至亞單層，棄原培養液，換為各藥物成分培養液，100 μL/孔，4個復孔，孵育24 h。棄藥物培養液，原位裝載NO探針，100 μL/孔。37 ℃細胞培養箱內孵育20～40 min。PBS洗3次。使用495 nm激發波長，515 nm發射波長，Thermo scientific varioskan flash光譜掃描多功能讀數儀上檢測。

1.2.7?Griess法?收集細胞培養液上清，96孔板每空加50 μL，在各孔中加入50 μL室溫Griess Reagent I，然后各孔中加入50 μL Griess Reagent II，酶標儀540 nm波長測定吸光度。

1.3?統計學方法?采用SPSS 12.0統計軟件包進行統計學分析。計量資料均數±標準差用（±s）表示。組間比較使用單因素方差分析。纖維化等級資料采用Ridit分析，免疫組化半定量分析采用image-pro plus 6.1圖像分析軟件。以P<0.05為差異有統計學意義。

2?結果

2.1?歐當歸內酯A對大鼠肝組織炎性反應與膠原沉積的影響?HE染色可見正常組肝小葉與肝細胞排列整齊，結構完整;模型大鼠肝組織可見肝細胞腫大變圓，脂肪空泡變性明顯，肝細胞散在壞死，成纖維細胞大量增生，匯管區及纖維間隔內可見大量炎性細胞浸潤。與模型組比較，歐當歸內酯A低劑量與高劑量組肝細胞變性和炎性反應壞死有所減輕。

天狼猩紅染色可見正常組大鼠肝小葉結構清晰，僅在匯管區有極少量膠原沉積;模型組可見大量膠原纖維沉積，部分形成纖維間隔，嚴重者偶可見假小葉形成;與模型組比較，歐當歸內酯A低劑量和高劑量組膠原沉積減少，高劑量組肝纖維化分級評分比較，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖1，表2。

2.2?歐當歸內酯A對CCl4肝纖維化大鼠肝組織MDA、SOD、NO、NOS的影響?與正常組比較，模型組SOD顯著降低，MDA顯著增高（P<0.01）;與模型組比較，歐當歸內酯A低劑量組MDA顯著降低（P<0.01），高劑量組SOD和MDA均顯著改善（P<0.05或P<0.01）。與正常組比較，模型組NO、NOS顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，歐當歸內酯A低劑量組NO顯著降低（P<0.05），高劑量組NO和NOS均顯著降低（P<0.05）。見圖2。

2.3?歐當歸內酯A對CCl4肝纖維化大鼠肝組織eNOS表達的影響?肝組織免疫組織化學染色及半定量分析顯示，與正常組比較，模型組肝組織eNOS光密度顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，歐當歸內酯A高劑量組eNOS光密度顯著降低（P<0.05）。見圖3。

2.4?歐當歸內酯A對SK-HEP-1細胞毒性及缺氧損傷模型細胞活力的影響?歐當歸內酯A設6個濃度：0 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L，藥物作用24 h，根據MTT結果，選擇與對照組比較無顯著性差異，且存活率>90%的濃度為最大無毒濃度，歐當歸內酯A對SK-HEP-1細胞最大無毒濃度為10 μmol/L。在最大無毒范圍內設3個濃度梯度組用于缺氧損傷的細胞，同時設正常和模型對照組，MTT結果顯示，歐當歸內酯A在2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L時對SK-HEP-1細胞氯化鈷損傷模型細胞活力均有保護作用。圖4。

2.5?歐當歸內酯A對SK-HEP-1缺氧損傷模型細胞vWF表達的影響?vWF免疫熒光染色顯示，與正常組比較，模型組熒光強度顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，歐當歸內酯A（2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L）對vWF熒光強度有不同程度的降低（P<0.01）。見圖5。

2.6?歐當歸內酯A對SK-HEP-1缺氧損傷模型細胞NO水平的影響?Griess法檢測細胞上清NO結果顯示，與正常組比較，模型組上清NO水平明顯升高（P<0.01）;與模型組比較，歐當歸內酯A能夠顯著降低氯化鈷損傷模型SK-HEP-1細胞上清NO（P<0.05或P<0.01）。熒光探針法檢測胞內NO顯示，與對照組比較，模型組NO表達明顯降低（P<0.05）;與模型組比較，歐當歸內酯A 10 μmol/L組NO表達明顯升高（P<0.01）。見圖6。

3?討論

慢性肝病過程中血管生成和血管活性物質（NO等）的表達改變、內皮功能障礙、神經激素失調和全身炎性反應狀態在調節肝硬化體內病理失衡和異常血管生成反應方面發揮著不同的作用[4]。慢性肝損傷可導致肝竇內皮功能障礙，內皮細胞損傷、毛細血管化是纖維化發生的早期事件和原因之一。肝竇內皮細胞存在于肝竇內壁，具有獨特的窗孔結構[5]，有利于促進肝細胞氧代謝，增強肝細胞與外界的物質交換;缺氧可使肝竇內皮細胞損傷發生表型改變[6]，vWF表達增加，窗孔結構破壞或消失，同時細胞功能障礙，NO等合成釋放改變;任其發展將進一步加重肝臟疾病如纖維化并形成難以逆轉的血管病理。歐當歸內酯A來源于中藥當歸、川芎等，研究報道其具有抑制肝星狀細胞增殖作用[7]，我們前期研究發現，歐當歸內酯A可顯著改善CCl4誘導的大鼠肝組織纖維化程度，抑制TGF-β1誘導的LX-2細胞活化;抑制肝竇毛細血管化，抑制ECGs誘導的肝竇內皮細胞增殖等作用[8]。本研究在此基礎上，通過體內外研究進一步探討歐當歸內酯A調節纖維化肝臟NO釋放的抗肝纖維化作用機制，動物實驗結果顯示歐當歸內酯A可有效抑制CCl4誘導的大鼠肝纖維化，與前期結果一致。

脂質過氧化是指在自由基的攻擊下，不飽和脂肪酸發生過氧化反應，從而生成一系列活性氧的復雜過程[9]，可造成器官、組織、細胞損傷。MDA是脂質過氧化的終產物之一，其含量可反映組織中脂質過氧化程度。SOD是機體清除自由基的主要酶，SOD活性高低反映肝組織清除自由基的能力[10]。本研究使用的CCl4誘導的肝纖維化動物模型具有脂質過氧化損傷特點[11]，模型組MDA顯著升高，SOD顯著下降，歐當歸內酯A可以升高SOD水平，對脂質過氧化損傷具有調節作用。

內皮細胞損傷時細胞功能變化主要體現在NO的合成釋放，vWF是細胞損傷的主要標志物。NO具有神經遞質，信使等功能，既是一種強大的血管擴張劑和細胞保護因子，也是細胞毒作用介導物;NOS是調節NO生物合成的重要因素。文獻報道，肝損傷可引起血清及肝組織中NO顯著升高，引起毒性作用，如抑制線粒體有氧呼吸、抑制肝細胞蛋白合成以及生成具有肝細胞毒性的過氧化亞硝酸鹽離子介導免疫性肝損傷。NO還可增加肝臟的血流量從而降低肝臟有氧代謝，從而發揮一定的保護作用[12]。CCl4誘導的急性或慢性肝纖維化動物模型中可觀察到血清NO及肝組織NOS活性明顯升高[13-14]。我們研究結果顯示，模型鼠肝組織NO和NOS顯著升高，歐當歸內酯A可顯著降低NO水平和NOS活性，提示對NO整體釋放具有調節作用。eNOS主要存在于內皮細胞、上皮細胞和心肌細胞，在肝纖維化和肝硬化肝組織都有表達[15]。本研究結果表明，在CCl4誘導的肝纖維化模型中，肝組織eNOS明顯升高，提示損傷導致內皮細胞產生和釋放NO功能發生改變，歐當歸內酯A治療后，隨著纖維化的改善肝組織eNOS表達顯著減少。氯化鈷化學誘導細胞缺氧損傷是體外研究常用的技術方法，廣泛應用于神經細胞、癌細胞、血管內皮細胞及平滑肌細胞缺氧研究[16]。體外實驗我們采用氯化鈷誘導具有肝竇內皮細胞特點的SK-HEP-1細胞建立缺氧損傷模型，損傷后細胞vWF表達顯著升高，上清NO水平升高，胞內NO下降，歐當歸內酯A可以降低vWF表達及上清NO水平，胞內NO上升，提示該藥對肝竇內皮細胞損傷具有保護作用。

綜上所述，歐當歸內酯A可抑制CCl4大鼠肝纖維化，減輕脂質過氧化損傷，降低肝組織NO和NOS水平，下調eNOS表達;其抗肝纖維化作用機制可能與保護肝竇內皮細胞缺氧損傷，調節NO釋放有關。

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（2020-09-10收稿?責任編輯：王明）