單側咀嚼對大鼠髁突軟骨細胞中p53、Bcl-2及caspase-12表達的影響

程 潔 張 棟 李 娟 閆桂艷 谷建琦

顳頜關節紊亂病是口腔科臨床的常見病、多發病，以關節彈響、疼痛、張口受限為主要臨床癥狀。本研究造模大鼠單側咀嚼模型，導致雙側髁突受力不均，髁突軟骨發生生理性及病理性改建。終身具有改建能力是髁突軟骨的重要生物學特征，因此短暫的咬合關系異?？赡懿粫︼D頜關節造成實質性的破壞，但長期單側咀嚼帶來的受力不均則可能導致顳頜關節紊亂病的發生，造成顳頜關節系統不可逆的改變。本研究通過檢測分析細胞凋亡通路中的關鍵蛋白，進一步探討髁突軟骨細胞的凋亡機制及相關蛋白的相互作用關系。

資料和方法

選取由河北醫科大學動物中心提供的3 周齡雄性SD 大鼠（3 周齡，體重160g～190g）96 只，隨機等量分為8 組，實驗組及對照組各4 組，每組12 只。適應性飼養一周后，拔除左側上、下頜所有磨牙，于拔牙后第1d、7d、14d、28d 取材。

動物造模及取材：實驗組大鼠經10%水合氯醛4ml/kg 腹腔注射麻醉后，拔除左側上、下頜所有磨牙，對照組不做任何處理。拔牙后第1d、7d、14d、28d，每組隨機選取6 只，完整取出雙側髁突關節軟骨，于多聚甲醛中固定。另外6 只，麻醉后直接取髁突軟骨凍存于-80℃冰箱中。對照組大鼠與對應實驗組同期處死并取材。

免疫組化染色：常規固定、包埋，將厚度4um 的組織切片脫蠟、入水后，3%甲醇雙氧水，室溫30 分鐘，自來水洗，采用熱修復方法之后放入PBS 中，然后進行劃蠟；切片上滴加山羊血清封閉液，室溫30分鐘；滴加第一抗體，4℃過夜，次日拿出來后等10～20 分鐘室溫平衡后放入PBS 中；滴加生物素化第二抗體（IgG），37℃20 分鐘，放入PBS 中；滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液（S-A/HRP），37℃20分鐘，放入PBS 中；DAB 顯色；蘇木素復染細胞核7～8S，脫水，二甲苯透明、中性樹脂封片。顯微鏡下觀察，使用美國Media Cybernetics 公司Image-Pro Plus v 5.1 軟件進行圖像分析。

實時定量PCR（RT-PCR）檢測：用Trizol 提取組織樣本中總RNA。取5μlRNA 用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，以檢測RNA 的完整性。用天根生物科技有限公司的TIANScript RT KIT 進行反轉錄為cDNA，實驗操作按產品說明書進行。設計引物序列進行擴增，β-actin 用作內定參考。PCR 反應程序：95℃15min，95℃10s，58℃30s，72℃30s，循環40 次。分別用目的基因引物和內參基因引物進行擴增。同時在60℃～95℃進行溶解曲線分析。

用熒光定量PCR 儀，采用2-△△CT法進行數據的相對定量分析。根據RT-PCR 原始檢測結果，按照2-△△ct相對定量計算公式，即：△△Ct＝[Ct目的基因（實驗組）-CtBeta基因（實驗組）]-[Ct目的基因（對照組）-CtBeta基因（對照組）]。計算出各樣品的目的基因相對定量結果，即其他各個樣品相對于對照樣品目的基因mRNA 轉錄水平的差異。

采用SPSS 19.0 統計軟件進行數據分析，不同時間點實驗組左、右側及對照組之間的比較，各實驗組內同側不同時間點的數據分析均采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1.免疫組化結果：鏡下選取5 個視野，計算陽性細胞數及陽性細胞顯色強度，從而得出免疫組化評分（IHS）的數值。caspase-12 在髁突軟骨細胞中的DAB 顯色為棕黃色，對照組陽性表達很少，陽性細胞主要位于肥大層（圖1）。實驗組左側IHS 評分1d，7d，14d，28d 時均顯著高于對照組（P＜0.05），陽性細胞分布于增殖層和肥大層；實驗組右側IHS 評分1d，7d，14d 時顯著高于對照組（P＜0.05），28d 時與對照組無顯著性差異（P＞0.05）。1d、7d、14d、28d組，實驗組左側IHS 評分逐漸升高，14d 較7d 組、28d 較14d 組升高有顯著性差異（P＜0.05）；實驗組右側IHS 評分逐漸降低，在7d，28d 時降低較前一時間點有統計學差異（P＜0.05），28d 時與對照組無顯著差異（P＞0.05）（圖2）。

圖1 對照組、實驗組左側及實驗組右側染色結果比較（免疫組化染色 ×400）

圖2 不同時間IHS 評分對比

表1 對照組和實驗組左、右側p53 含量在不同時間段的變化

表2 對照組和實驗組左、右側Bcl-2 含量在不同時間段的變化

2.RT-PCR 結果：由于對照組p53 和Bcl-2 含量在不同時間點的左右側對比均無統計學差異（P＞0.05），所以分別將不同時間點對照組的左、右側合并為一組。拔牙后1d 時，實驗組右側p53 含量＞實驗組左側＞對照組，差異有統計學差異（P＜0.05）；Bcl-2 含量實驗組左側和右側均高于對照組（P＜0.05），實驗組左側高于實驗組右側，但無統計學差異（P＞0.05）。拔牙后7d 時，實驗組左、右側均高于對照組（P＜0.05），實驗組左側高于實驗組右側，但無統計學差異（P＞0.05）；Bcl-2 含量實驗組左側和右側均高于對照組（P＜0.05），實驗組右側高于實驗組左側（P＞0.05）。拔牙后14d 時，實驗組左側p53含量＞實驗組右側＞對照組，差異有統計學差異（P＜0.05）；Bcl-2 含量實驗組右側＞實驗組左側＞對照組，差異有統計學差異（P＜0.05）。拔牙后28d時，實驗組左側p53 含量明顯高于實驗組右側和對照組（P＜0.05），實驗組右側與對照組無統計學差異；Bcl-2 含量實驗組左側明顯低于實驗組右側和對照組（P＜0.05），實驗組右側與對照組無統計學差異。隨時間延長縱向比較，實驗組左側p53 含量1d、7d、14d、28d 逐漸升高的趨勢，14d 組較7d 組顯著升高（P＜0.05），28d 組較14d 組顯著升高（P＜0.05）；實驗組右側p53 含量逐漸降低的趨勢，14d 組較7d組顯著降低（P＜0.05），28d 組較14d 組顯著降低（P＜0.05）。Bcl-2 在實驗組左側的表達逐漸降低，14d 組較7d 組顯著降低（P＜0.05），28d 組較14d 組顯著降低（P＜0.05）；Bcl-2 在實驗組右側的表達逐漸增強，14d 組較7d 組顯著增強（P＜0.05），28d 組較14d 組顯著增強（P＜0.05）。

討 論

顳頜關節紊亂病以髁突的病理性改變為主要病理學特征，許多學者對各種外界刺激導致的髁突軟骨的退行性改變做了大量研究[1～4]。本研究對單側拔牙后，大鼠雙側髁突承受壓力失衡導致的髁突軟骨細胞的退行性改變進行相關凋亡通路中關鍵蛋白的檢測，了解髁突軟骨細胞的凋亡途徑。

p53 蛋白主要分布于細胞核漿，由于p53 蛋白易降解，因此正常細胞中p53 的蛋白水平較低。p53可整合多種壓力刺激信號并隨之影響細胞[5]。氧化應激反應下，細胞DNA 受損時，p53 的表達上調，阻止DNA 復制，為DNA 修復創造條件，若DNA 修復失敗，則引發細胞凋亡反應[12]。p53 蛋白受到多種調控因子的作用[6，7，11]。p53 通過激活其下游的p21 WAF1/CIP1 基因介導細胞凋亡。

Bcl-2（B-cell lymphoma-2），屬膜整合蛋白，位于線粒體、內質網、連續的核周膜，有促進細胞存活，抑制細胞凋亡的作用[8]。Bcl-2 可阻止線粒體釋放細胞色素C，發揮抗凋亡作用；而Bax 通過與線粒體上離子通道的相互作用可介導細胞色素C 的釋放，促進凋亡[8，9]。p53 可通過增加Bax 的表達，降低Bcl-2的表達，共同完成促進細胞凋亡作用。p53 通過對Bcl-2 的基因轉錄抑制或蛋白修飾來拮抗Bcl-2 的功能，p53 也可直接抑制Bcl-2 的功能。也有研究表明p53 可與Bcl-2 直接結合，抑制Bcl-2 的功能[10]。

caspase-12 屬于caspase 家族，是一類半胱氨酸蛋白酶，是內質網凋亡通路中的關鍵蛋白。細胞受到氧化應激反應后發生內質網應激，導致內質網發生蛋白錯誤折疊或未折疊蛋白增多，激活caspase-12，經過一系列的級聯反應最終由caspase-3 執行細胞的凋亡反應。許多學者對caspase-12 在髁突軟骨中的作用也做了大量研究，發現caspase-12 參與了髁突軟骨細胞的內質網應激介導的凋亡反應[13～15]。

本實驗結果顯示實驗組大鼠拔除左側磨牙后，導致咬合關系的突然改變，進而致雙側髁突受力發生改變，髁突軟骨細胞受到力學系統改變激發應激反應。左側咀嚼壓力突然降低，且拔牙后的炎癥反應引起細胞DNA 損傷，RT-RCR 結果顯示實驗組左側p53 的表達上調，較對照組增加有顯著性差異，實驗組右側由于咀嚼壓力的突然增大，也導致髁突軟骨細胞中p53 含量增加明顯。p53 的上調導致Bcl-2的表達下降，實驗組左側和右側的軟骨細胞中Bcl-2 含量逐漸降低。驟然增加的咀嚼壓力導致髁突軟骨細胞胞漿中的Ca+濃度增加，多余的Ca+被轉運至線粒體或內質網，內質網的Ca+超載導致內質網發生超負荷反應，進而使caspase-12 增加。免疫化染色結果顯示實驗組左側的caspase-12 逐漸增加，且14d 較7d 組、28d 較14d 組增加有顯著性差異，這與RT-RCR 的結果一致，進一步驗證了以上反應機制。組織學變化顯示實驗組右側1d、7d、14d 組的免疫組化染色caspase-12 的HIS 評分增加，即肥大層的棕黃色染色細胞增加，說明p53 激活p21 WAF1/CIP1 進一步發生凋亡反應，內質網凋亡通路的關鍵蛋白caspase-12 表達增加，進一步激活caspase-9，最終由caspase-3 執行凋亡反應。隨時間延長，右側髁突對新的壓力逐漸適應，實驗組右側caspase-12 的HIS 評分減少至與對照組無顯著性差異，表明隨著軟骨細胞內DNA 修復的進行，右側p53 逐漸下調，而抑制細胞凋亡的Bcl-2 表達逐漸增強，細胞凋亡被抑制，caspase-12 表達也逐漸降低，組織逐漸恢復正常，而左側髁突缺乏正常的咀嚼壓力刺激，發生廢用性萎縮，實驗組左側的p53 含量逐漸增高，Bcl-2 受抑制呈下降趨勢?？梢妴蝹群笱廊笔е碌碾p側髁突軟骨受力不平衡，初期雙側髁突軟骨均出現病理性改變，誘導促凋亡蛋白表現出p53、caspase-12 表達增強，抗凋亡蛋白Bcl-2 含量降低，啟動細胞凋亡反應，隨時間延長，右側髁突逐漸適應新的外力負荷，p53、caspase-12 表達下降，細胞增殖與凋亡反應逐漸恢復平衡。本研究采用了免疫組化和RT-PCR 兩種檢測方法，通過免疫組化，我們可以定位檢測蛋白質，陽性的強弱表示量的多少，也就是它與配體或抗體的結合的量；RT-PCR 實質上是對mRNA 的擴增，可據此分析某一特異基因在組織細胞中的表達情況，用作基因的定量測量，這兩種檢測方法結合，更加全面地分析了蛋白質的產生地和產生能力。