利用BD FACSAria Ⅲ二次分選法純化低比例細胞群體的流式細胞技術

首都醫科大學醫學中心實驗室 （北京 100069）

內容提要：目的：利用BD FACSAria Ⅲ流式細胞儀，通過兩次分選獲得高純度的GFP陽性HEK293T細胞。方法：GFP-px458空載質粒轉染的293T細胞，通過流式細胞儀yield結合purity模式對細胞進行兩次分選，比較二次分選后陽性細胞的純化率與細胞分別經yield 和purity單次分選的差異并對分選后細胞進行7-AAD染色鑒定分選后細胞的活性。結論：使用BD FACSAria Ⅲ型流式細胞儀的yield加purity模式可將低表達量3.1±1.0%且分群不明顯的GFP+293T純化至96.5±1.1%，且活性良好，是一種可靠的獲取高純度目的細胞的方法。

免疫磁珠法和流式細胞分選法是目前純化活細胞最常用的兩種技術，其中，流式細胞分選技術因其高通量，多參數多熒光，且能實現四路同時分選而有更為廣泛的應用[1]?？焖佾@取足夠數量的高純度活細胞是目前對分選實驗的基本要求。BD FACSAria Ⅲ是目前實驗室應用比較廣泛的流式細胞儀，該儀器特點是操作簡便，能夠利用Accurdrop beads快速準確調節分液滴延遲，且存在sweet spot分選液流監控系統保證液流斷點穩定。目前，利用流式細胞儀分選獨立群體CD4，CD8陽性細胞效果優于免疫磁珠分選，分選后細胞回測，目的細胞能達到90%以上，但對于分選低表達，目的細胞陽性率在0%～5%，且陽性細胞熒光分布彌散的樣品，往往存在純化率不高，分選時間過長，從而導致細胞活性差等問題[2,3]。FACSAria Ⅲ根據收集原理不同設置有purity（純化）、4 way purity（四路純化）、yield（富集）和single cell（單細胞）四種分選模式可選，可根據實驗要求選擇分選模式從而得到不同純度的細胞。本文以攜帶GFP報告基因的PX458空載質粒轉染HEK293T細胞為例，利用流式細胞儀上yield分選模式與purity分選模式相結合，縮短分選時間，提高目的細胞分選陽性率，獲得純度及數量更高的目的細胞。

1.材料與方法

1.1 實驗材料及主要試劑

攜帶GFP報告基因的PX458空載質粒轉染HEK293T細胞，由首都醫科大學基礎醫學院提供，Accudrop beads，CST beads購自BD公司，7-AAD試劑購自Biolegend公司，分選使用儀器為BD FACSAria Ⅲ，美國BD公司產品，分選用鞘液為PBS緩沖液，配制后以0.22μm濾膜過濾并高壓滅菌，冷卻后使用。

1.2 方法

1.2.1 流式細胞儀分選前液流參數的調節

打開FACSDiva軟件并運行開機程序，安裝85μm噴嘴打開分選液流Stream，參數的調節主要涉及主液流液滴斷點的調節和液滴延遲的調節。首先根據儀器說明書指導，使用85μm噴嘴時液滴頻率Freq設定為47，上下調節液滴振幅Ampl以確定適合的Gap值，輸入能夠讓液滴斷點穩定的Drop1值和Gap值，而后選中主液流框的sweet spot鍵，儀器會自動確定液滴頻率使液流穩定。上樣CST質控微球運行CST程序以檢測儀器光路狀態穩定，待液流光路均為穩定狀態后調節分選液滴延遲。上樣Accudrop beads微球，調節上樣速度為800～2000evt/s，打開分選電壓和濾光片圖標（Optical Filter），選中Auto Delay鍵，系統自動調節液滴延遲數值，使得微球在initial或fine tune模式下都達到側液流偏轉以99%以上。

1.2.2 流式細胞分選

GFP+的HEK293T：以未轉染的HEK293T細胞為對照設門確定GFP+細胞的位置；調節上樣速度4500～5500evt/s，將細胞分成3份，分別采取yield模式，purity的模式，yield分選后將細胞離心去除部分PBS上清并重懸，細胞再次purity模式分選。

1.2.3 分選效率檢測以及分選后細胞活力檢測

3種模式最終分選后的GFP+HEK293T細胞各自分成2份，一份再次上機進行分選后純度檢測，另外一份離心后去上清PBS重懸至體積300μL后加入1μL 7AAD上流式細胞儀檢測分選后細胞死活情況。

1.3 統計學分析

2.結果

2.1 流式細胞儀液流斷點及液滴延遲

使用85μm噴嘴進行分選，頻率設定為47，第一滴液流斷點位置Drop1為275，Gap為8，此時開啟“sweet spot”自動分選模式，振幅自動調節在24.6的位置（圖1），上樣Accudrop beads后調節Drop Delay值為29.17，此時在initial和fine tune兩種模式下側液流偏轉均可達99%以上（圖2），液流開啟0.5h以上無晃動，無斷點位置改變，說明穩定性良好，各種參數符合分選條件。

2.2 GFP+HEK293T細胞分選模式與純度

分選前GFP+細胞百分比為3.1±1.0%，將細胞分為三組分別采用yield，purity，yield分選后再次purity模式進行分選，分選后細胞進行回測，GFP+細胞得率依次為yield+purity模式，purity模式，yield模式，陽性率的差異有統計學意義（P＜0.5），結果見圖3，表1。三種模式分選后所得細胞經7AAD染色，活細胞百分比無顯著差異（P＞0.5），見圖4。

圖1.調節后穩定的液流斷點狀態

圖2.液滴延遲調節結果

圖3.GFP+細胞純度檢測

圖4.細胞活性檢測

表1.不同模式下分選前后GFP陽性率和細胞活性(7-AAD染色)(每組n=3,±s,%)

表1.不同模式下分選前后GFP陽性率和細胞活性(7-AAD染色)(每組n=3,±s,%)

注：與分選前比較，aP＜0.5，與上一組比較，bP＜0.5。

分選前 Yield模式 Purity模式 Yield+purity模式GFP陽性率 3.1±1.0 86.2±0.8a 92.0±1.4ab 96.5±0.6abimages/BZ_25_1252_1593_2267_1645.png

3.討論

使用流式細胞儀分選，其分選后純度和活性會受多方面的影響。第一，儀器自身狀態：包括液流的穩定性，液滴延遲時間的確定，激光信號的校準[4]。穩定的液流是準確分選首要條件。開啟液流窗口的“sweet sopt”自動監控功能按鈕有助于維持分選液流穩定狀態，當實際Gap值大于設定值±2時即液流穩定性變差時分選會自動停止。液滴延遲是用來設置細胞檢測點與斷點之間的時間間隔，精確的液滴延遲是通過分選Accudrop Beads的效果校正得到。此外，樣品分選前儀器需運行CST程序檢測儀器激光強度及變異系數才CV是否在正常范圍內[5]。

第二，分選模式的選擇。BD FACSAria Ⅲ屬于電荷分選型流式細胞儀，細胞通過檢測區域后會被高頻率的振蕩斷裂成均勻的小液滴，包裹有目標細胞的液滴會被加相應的電荷，樣品上機后，分選模式的選擇直接決定著哪部分細胞被看作目的細胞而后加電壓打入收集管。BD FACSAria Ⅲ提供了yield，purity，4-way purity，single cell四種分選模式，其中yield模式得率最高，分選速度最快，但純度欠佳，為了保證純度往往選擇purity模式，四路同時分選式選擇4-way purity，single模式一般單克隆細胞分選，此模式得到的細胞為單個陽性細胞，含有兩個或多個陽性細胞的液滴被拋棄，因此率最低。本實驗采取yield加purity的模式和模式進行二次分選，首先將表達量低的陽性細胞利用yield模式進行富集，在能夠保證effiency為100%的情況下采取盡量快的速度上樣，這樣能夠將陽性細胞迅速富集變成優勢細胞，使得GFP陽性細胞86.2%±0.8%，收集后的細胞1000轉5min稍離心，吸除部分上層PBS后再次利用purity模式分選，調節上樣速度，使得effiency在90%左右，最終將所分細胞陽性率純化至96.5±0.6%。

在細胞分選過程中，縮短分選時間也是需要考慮的問題之一。先富集，再分選，有助于縮短分選時間提高分選陽性率。預富集的方式常用的有如下幾種：流式細胞儀的enrich模式，適用于熒光表達量低且細胞能夠抗液流壓力的樣本；免疫磁珠陰選法對于多色標記淋巴細胞富集效果良好[6]；對于外周血來源的樣本，淋巴細胞分離液結合密度梯度離心法能夠對淋巴和單核細胞起到富集作用[7,8]。

由于FACSAria Ⅲ屬于液流電壓分選型流式細胞儀，因此分選過程中細胞一定會受到儀器液流系統壓力的影響，過大的壓力會造成細胞破碎或是死亡，分選過程中需根據細胞大小不同選擇不同噴嘴，噴嘴過小影響大細胞通過，且細胞承壓過大，而噴嘴過大則不能將細胞有效地在噴嘴位置排隊成單細胞，從而影響分選精度，本實驗采取85μm噴嘴分選GFP+的HEK293T，分選后利用7-AAD染色檢測細胞活性，兩次分選與分選前無顯著性差異，說明目前儀器噴嘴和壓力條件適用于該細胞的分選，但是對于不同形態大小的細胞，使用的噴嘴規格尚需要摸索。除此之外，每次細胞分選時會利用儀器檢測系統的FSC閾值切除細胞碎片，FSC-A和FSC-H排出黏連細胞，也會主觀排除碎片或黏連體，有利于最終分選到的細胞是單一的，狀態良好的細胞。

本實驗利用FACSAria Ⅲ流式細胞儀的yield結合purtity兩種分選模式相結合，對GFP+的HEK293T進行兩次分選，使得最終獲得的陽性細胞達到了96.5%±0.6%，較單一模式分選法有所提高，分選的時間縮短，且分選后的細胞活性良好，是一種可靠的，獲取高純度陽性細胞的方法。