模擬移動床分離D-果糖與D-阿洛酮糖的色譜模型參數及傳質系數測定

周錦怡 武國慶 郭元亨 陳博 武麗達 李義 佟毅

摘 要：以固定化酶催化轉化后的D-果糖及D-阿洛酮糖的混合糖漿為原料，采用陰陽離子樹脂對反應后的混合糖漿進行脫鹽預處理，脫鹽后的電導率為（14.4±0.5）μs·cm-1。對D-果糖及D-阿洛酮糖在不同類型樹脂上的保留行為及分離效果進行研究，確定了DOWEX 310Ca樹脂為適宜的固定相。此外，在不同流速條件下測定了固定相DOWEX 310Ca樹脂的色譜柱參數并計算得到兩組分的傳質系數。本研究獲得的色譜模型參數及傳質系數可以為后續D-阿洛酮糖產品分離實驗、生產優化操作及工業化放大設計提供基礎數據。

關鍵詞：D-阿洛酮糖;D-果糖;傳質系數;模擬移動床;色譜分離

Abstract：The mixed syrup of D-fructose and D- psicose that produced by immobilized enzyme catalysis process， were used as the raw material during the separation process. The mixed syrup subjected to desalination pretreatment with anion and cationic resin. The conductivity after desalination of （14.4 ± 0.5） μs·cm-1. The retention behavior and separation effect of D-fructose and D-psicose on different types of resin were studied， and DOWEX 310Ca resin was determined as a suitable stationary phase. The column parameters of the stationary phase DOWEX 310Ca resin were measured under different flow rates， and the mass transfer coefficients of the two components were calculated. This study provided basic data for subsequent D-psicose product separation experiments， production optimization operations， and industrial scale-up design.

Key words：D-Psicose; D-Fructose; Mass transfer; Simulated moving bed; Chromatographic separation

中圖分類號：TS245.4

目前，世界范圍內糖尿病、高血壓和高脂血癥等肥胖相關疾病的患病率和發病率顯著增加[1]，根據有關研究表明，全球2010年大約有2.8億人患有糖尿病，預計到2030年患者將會增加至4.3億，高脂肪、高熱量食品是導致這種情況的主要原因。在這一背景下，國家越來越重視食品的安全性和對人體健康的影響。2017年，國務院辦公廳發布的《中國防止慢性病中長期規劃》（2017—2025年）指出，以健康促進和健康管理為手段，到2020年降低慢性病導致的過早死亡率較2015年降低10%。積極開展慢病防治是推動由疾病治療向健康管理轉變的重要手段，因此，飲食中糖分的“健康攝取”成為新的健康課題，其中，低熱量甜味劑的開發和應用是最為有效的途徑之一[2]。

D-阿洛酮糖作為一款新型甜味劑，其甜度約為蔗糖的70%，熱量約為蔗糖0.3%。與其他天然甜味劑相比，D-阿洛酮糖的熱值明顯偏低，與蔗糖相比，D-阿洛酮糖可同等程度的滿足消費者對甜味的味覺需求，其甜味溫和，且甜度不隨溫度變化而變化，是一款蔗糖的完美替代品[3]。此外，研究表明，D-阿洛酮糖能明顯抑制體重的增加和腹部脂肪的堆積，每天攝入超過6.7%總碳水化合物的D-阿洛酮糖，可以明顯抑制餐后血糖水平[4]。因此，D-阿洛酮糖在控制肥胖和糖尿病治療方面具有極大的潛力，可以作為糖尿病人食用的新型甜味劑，具有良好的應用前景[5]。

目前，D-阿洛酮糖主要通過生物合成制得[5]。生物合成法以果糖為底物，通過D-阿洛酮糖3-差向異構酶的催化生成阿洛酮糖[6-7]。經過異構酶催化轉化得到的D-阿洛酮糖與未轉化的D-果糖最終會同時存在于溶液體系中。從圖1可以看出，果糖及阿洛酮糖結構十分相近[8]，因此采用普通的方法很難實現將二者分離開來，目前多采用色譜分離法，主要包括離子交換色譜[9-10]和模擬移動床色譜[11-12]等。其中，模擬移動床（SMB）色譜技術具有節約流動相、自動化程度高、分離效率高、操作費用小等優勢，近年來在食品行業中應用得到快速發展，尤其是在糖類工業中已得到大規模的應用[13]。其中，果糖與葡萄糖的分離是SMB在糖類成分制備中起步最早的，也是目前制糖工業分離中規模最大的[14]。20世紀80年代，美國UOP公司采用Sarex分離過程，以Ca型離子交換樹脂或者分子篩作為填料，水作為洗脫機，首次實現葡萄糖與果糖的分離[15]。當前，SMB分離果葡糖漿已經在我國實現大規模生產。中糧生化能源（公主嶺）有限公司、中糧上海（融氏）生物科技有限公司均建成了年產10萬噸以上的F55生產線[12]。此外，SMB也用于木糖[16]、阿拉伯糖[17]、海藻糖[18]、甜葉菊甙[19]的分離，目前在國內企業均實現產業化應用。

中糧營養健康研究院在小試的基礎上，采用SMB技術對混合糖漿中D-果糖及D-阿洛酮糖進行分離純化，阿洛酮糖純度可以到98%，收率達到70%。雖然目前采用SMB分離可以達到較好的效果，但是操作參數仍有很大的優化空間，通過優化工藝參數，可以進一步降低生產成本，提高工藝經濟性。對于SMB分離過程而言，溶質的傳質性質的研究不僅是色譜分離的基礎，也是工業色譜放大及優化的重要前提[20]。因此，需要通過實驗對D-果糖與D-阿洛酮糖的傳質等動力學數據進行測定，為后續模擬和優化SMB提供基礎數據。

1 模擬移動床色譜分離原理

1.1 D-果糖與D-阿洛酮糖分離原理

在SMB分離過程中，固定相直接影響吸附選擇性、保留時間和載量，因此固定相的選擇至關重要。最早用于果葡糖漿分離介質的是分子篩，固定K+的X型沸石對葡萄糖具有吸附作用，而固定有NH4+、Na+、Ca2+或Ba2+離子的沸石對果糖具有吸附選擇作用。目前廣泛應用的分離介質是離子交換樹脂，其較沸石具有更好的穩定、均勻性及再生性能[21]。20世紀80年代，美國UOP公司將Ca2+離子交換樹脂作為分離介質用于果糖與葡萄糖的分離，并實現大規模工業化生產。離子交換樹脂是利用不同類型的糖與陽離子親和力的差異實現分離的目的。理想的陽離子和糖的結合模型中，相鄰的羥基具有2對軸向-平伏的排列（a-e），沒有平伏-平伏的羥基排列（e-e），如圖2所示。Goulding研究發現，相鄰羥基的a-e排列與陽離子的結合能力遠大于e-e排列，即a-e排列越多，結合越牢固，如β-D-吡喃果糖有兩對不相鄰的a-e排序，而β-D-吡喃D-葡萄糖沒有a-e的排序[21-22]。分析D-阿洛酮糖的構型，其軸向-平伏鍵的排列最接近于理想模型（如圖3所示），因此與陽離子的結合最為牢固。因此從理論上講，陽離子交換樹脂是有可能將D-果糖與D-阿洛酮糖相互分開的。

1.2 SMB分離原理

SMB色譜技術的分離原理與真實移動床（TMB）基本相同，是基于固定相對各組分的吸附能力的強弱差異進行分離。在TMB分離過程中，固定相由于重力作用，自上而下地移動，到達底部后，解吸完全的固定相被提升到頂部重復使用;流動相則由下而上移動。SMB的不同點是吸附顆粒被裝填后不再移動，而是由原料進口和產品液流出口之間不斷切換的方法，通過形成吸附顆粒和液流的相對逆流運動來模擬固定相的移動，典型的四帶結構SMB如圖4所示[23]。

1.3 單柱色譜模型

SMB模型由單柱色譜模型和各區帶間的銜接條件構成。單柱色譜模型基于吸附床層微元內的物料守恒，是研究色譜分離過程的基礎，也是過程進行設計及優化的前提[24]。目前，常見的色譜模塊包括一般速率模型（GR模型）、理想模型、平衡擴散模型及集總動力學模型等。其中，平衡擴散模型和集總動力學模型是在理想模型的基礎上發展而來。由于傳質阻力不可忽略，因而采用集總動力學模型測定色譜模型參數，該模型的模型方程見式（1）：

組分k在固定相中的傳質平衡方程見式（2）：

2 材料與方法

2.1 材料與儀器

D-果糖（VWR公司）、D-阿洛酮糖（上海立足生物科技有限公司），均為色譜純;實驗用水，均為Milli-Q水凈化系統制備的超純水（Millipore，Bedford，MA，USA）。

LX-160型陽離子交換樹脂、D-354型陰離子交換樹脂，西安藍曉科技新材料股份有限公司生產;DOWEX 310 Ca特種凝膠型陽離子交換樹脂，陶氏化學公司生產;Agilent 1260高效液相色譜分析系，美國Agilent公司生產;Centrifuge 5424恒溫水浴鍋，德國Eppendorf公司生產;RE-2002旋轉蒸發器，北京神泰偉業儀器設備有限公司生產;PAL-1手持糖度儀，日本ATAGO（愛拓）公司生產;KQ-500DE數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司生產。

2.2 實驗方法

2.2.1 高效液相色譜定量分析

配制20 g·L-1 D-果糖及D-阿洛酮糖標準液，依次稀釋成1、2、5、7 g·L-1和10 g·L-1。采用Agilent 1260系列高效液相色譜（HPLC）系統測定混合糖漿中D-果糖及D-阿洛酮糖的含量，以標準品濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標分別繪制D-果糖及D-阿洛酮糖的標準曲線，根據標準曲線對分離前后的D-阿洛酮糖濃度進行定量分析。HPLC系統包括G1311C四元泵、G1316A柱溫箱、G1329B自動進樣系統和G1236A示差檢測器，色譜柱為Waters sugar-PakI （10 μm，6.5 mm×300 mm）;柱溫為80 ℃，RID檢測溫度為55 ℃，流動相為水，流速為0.4 mL·min-1。所有樣品進樣前均使用0.45 μm的微濾膜過濾，樣品進樣量為20 μL。

2.2.2 樣品溶液制備及預處理

前處理工藝流程如圖5所示。以D-果糖為原料，通過樹脂固定化酶進行異構化反應，反應結束后，通過抽濾實現混合糖漿與樹脂固定化酶的分離，固定化酶回收利用進行下一次催化反應，混合糖漿進行脫鹽處理，除去溶液中殘留的離子。通過LX-160型陽離子交換樹脂脫除金屬陽離子，采用D-354型陰離子交換樹脂脫除陰離子，使溶液的電導率為下降到50 μs·cm-1以下。脫鹽后的反應液進行旋轉蒸發，濃縮至干固含量為50%備用。

2.2.3 固定相的篩選

SMB分離技術中，固定相和流動相的選擇至關重要。對于糖類的分離，流動相通常采用純凈水[21]，因此固定相的選擇尤為重要。色譜分離中，樹脂的吸附選擇性越高，分離效果越好。采用高效液相色譜（HPLC）對DOWEX 310Ca、DOWEX 310Na、DOWEX 310K及DOWEX 310H四種陽離子交換樹脂分離效果進行評價。其中，流動相為去離子水，流速10 mL·min-1，色譜柱溫度60 ℃，檢測器采用示差折光檢測器，所有樣品進樣前均使用0.45 μm的微濾膜過濾。

2.2.4 色譜柱孔隙率的測定

孔隙率是色譜柱重要參數之一[25]。對于凝膠型色譜柱，一般采用藍葡聚糖作為示蹤劑[27]。通過測定示蹤劑在DOWEX 310Ca色譜柱上的保留時間，計算出色譜柱的孔隙率ε，如式（3）所示。

式（3）中，V0-系統死體積，VD-色譜柱孔隙體積;

V-色譜柱體積。

色譜實驗條件為：柱溫60 ℃，在流量10～14 mL·min-1條件下脈沖進樣1 g·L-1的藍葡聚糖示蹤劑，設置紫外檢測器記錄藍葡聚糖的流出曲線，紫外檢測波長254 nm。

2.2.5 傳質系數的測定

對于二元組分，色譜柱上微元段的物料衡算方程見式（4）[25]。

組分的理論板數N與脈沖實驗流速u、傳質擴散系數DL及總傳質系數km有關[26]，根據上述條件可推到出式（7）。

2.3 數據分析

本實驗全部實驗數據用WPS Office表格進行統計處理，數值以均值±標準差表示，采用軟件Origin 9.1進行繪圖。

3 結果與分析

3.1 高效液相色譜定量分析

D-果糖和D-阿洛酮糖的標準曲線如圖6、圖7所示，所得的回歸方程如式（8）、式（9）所示。

3.2 固定相的篩選結果

通過單柱脈沖實驗考察了不同類型的樹脂對于D-阿洛酮糖與D-果糖的分離情況，結果如圖8（a）～圖8（d）所示。分離過程中兩種糖類的保留行為（保留時間μ與σ2方差）結果如表1所示。

從上述結果可以分析得出，由于不同型號的樹脂性能上的差別，導致相同分離條件下分離結果存在差異。樹脂的離子型式對于保留行為和分離性能有較大影響，對于阿洛酮糖，Ca型樹脂保留性能最強，K型和Na型樹脂保留性能居中，H型樹脂保留相對較弱，體現在峰展寬和保留時間的不同。綜合分析，選擇分離效果最好Ca型陽離子交換樹脂作為SMB色譜分離的分離介質。

3.3 孔隙率及傳質系數測定結果

根據式（3）中流動相流量Q與出峰時間t的可以測定色譜柱孔隙率V0，具體實驗結果見表2。

除了樹脂的選擇以外，傳質系數是色譜分離性能極為重要的判斷依據[27]。在流速5～10 mL·min-1的實驗范圍內測定D-果糖及D-阿洛酮糖的流出曲線，實驗結果見表3。

理論板數N與u·λ的關聯結果見圖9。

D-果糖與D-阿洛酮糖的擬合方程見式（10）及式（11）：

從圖7可以看出不同流速下u·λ與1/N均呈線性相關，根據圖9的斜率和截距并結合式（7）可以得到D-果糖及D-阿洛酮糖的理論板數及傳質系數：

4 結論

本文對混合糖漿中阿洛酮糖的分離過程進行研究。采用陽-陰離子樹脂，對酶催化轉化反應后的混合糖漿進行脫鹽預處理，脫鹽后的電導率為（14.4±0.5）μs·cm-1。對分離D-果糖及D-阿洛酮糖的固定相進行篩選，通過考察D-果糖及D-阿洛酮糖在不同類型樹脂上的保留行為及分離效果，確定DOWEX 310Ca樹脂為適宜的固定相。對D-果糖和D-阿洛酮糖的色譜模型參數及傳質系數進行測定，在流速5～10 mL·min-1的范圍內，D-果糖和D-阿洛酮糖的傳質系數分別為4.84 min-1及24.2 min-1，色譜柱孔隙率為0.092，為后續進一步優化SMB分離過程提供基礎參數。

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