翹嘴鱖·斑鱖·雜交鱖不同組織3種同工酶特征研究

梁家僖 薛源 史楊白

摘要 揭示翹嘴鱖、斑鱖和雜交鱖F1 [翹嘴鱖（♀）×斑鱖（♂）]的同工酶生化遺傳特性。采用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（Native-PAGE）檢測技術，分別進行了斑鱖、翹嘴鱖3個組織（肌肉、肝臟、腎臟）以及雜交鱖F1代5個組織（肌肉、肝臟、心臟、腎臟、腦）的3種同工酶（LDH 1.1.1.27、MDH1.1.1.37、EST3.1.1.1）酶譜特征的研究。3種同工酶均存在較穩定的物種和組織特異性表達的特征;雜交鱖F1代同工酶酶譜的組織表達與雙親（斑鱖、翹嘴鱖）之間存在明顯的親緣關系和特異性，除了斑鱖和翹嘴鱖腎臟中的MDH同工酶譜以外，3個不同鱖種間的酶譜特征均存在較明顯的種屬特異性，肝臟、腎臟中的LDH和EST同工酶譜以及肌肉中的EST同工酶譜均存在顯著且穩定種屬特異性差異表達，可作為鑒別3種鱖魚種質特性的重要遺傳生化參考指標。該研究結果為鱖魚的種質鑒定和雜交育種提供了一定的理論依據，并具有較好的應用價值。

關鍵詞 翹嘴鱖;斑鱖;雜交鱖;同工酶

中圖分類號 S917.4 ?文獻標識碼 A ?文章編號 0517-6611（2020）21-0109-06

Abstract In order to reveal the isozyme genetic characteristics of Siniperca chuatsi， Siniperca scherzeri and hybrid mandarin fish ?[Siniperca chuatsi （♀） × Siniperca scherzeri （♂）]， using native polyacrylamide gel vertical electrophoresis technology， three isozymes （LDH 1.1.1.27， MDH1.1.1.37， EST3.1.1.1） of five tissues （muscle， liver， heart， kidney， brain） of hybridization F1 and three tissues （muscle， liver， kidney） of Siniperca chuatsi， Siniperca scherzeri were analyzed. The results showed that there were stable species and tissue specific expression characteristics in three isozymes. The tissue expression of isozyme of hybridization F1 had obvious relationship and specificity with its parents [Siniperca chuatsi （♀） × Siniperca scherzeri （♂）]. Except for the MDH isozyme zymogram of kidney of Siniperca scherzeri and Siniperca chuatsi， the isozyme characteristics of three species of mandarin fish showed significant species specificity. The LDH and EST isozyme zymogram of kidney and liver and EST isozyme zymogram of muscle had remarkable and stable species differential expression，which could be used as a key biochemical indicator to distinguish the germplasm characteristics of three species of mandarin fish. Therefore， the results of this study provided a theoretical basis for germplasm identification and hybrid breeding of these three species of mandarin fish， and had a good application value.

Key words Siniperca chuatsi;Siniperca scherzeri;Hybrid mandarin fish;Isozyme

基金項目 蘇州大學校級大學生創新創業訓練計劃（2019xj069）;江蘇省重點研發計劃（現代農業）（BE2017311）;江蘇省漁業科技類項目（Y2017-38）;江蘇省重點研發計劃（現代農業）（BE2018398）。

作者簡介 梁家僖（1996—），女，廣西梧州人，從事魚類生物學研究。*通信作者，副教授，博士，從事水生生物學研究。

收稿日期 2020-02-29

斑鱖（Siniperca scherzeri）和翹嘴鱖（Siniperca chuatsi）同屬鱸形目、鱸亞目、鮨科、鱖亞科、鱖屬，均為肉食性底棲兇猛魚類，營掠性攝食方式，肉質細嫩，味道鮮美，是名貴的經濟魚類。斑鱖的運動和捕食能力較翹嘴鱖強[1]，肌肉蛋白質含量顯著高于翹嘴鱖（P<0.05）[2]，但翹嘴鱖的生長速度快且體型較大，具有更高的商業養殖價值。利用父本斑鱖體型、體色、優良品質和母本翹嘴鱖生長速度快的雙親遺傳特性開展雜交育種獲得的雜交鱖可顯現出明顯的優良性狀，具有較好的商業開發前景[3]。目前，對翹嘴鱖、斑鱖及其雜交種的研究主要集中于親本與雜交鱖的生物學特征分析[4]、雜交鱖的胚胎發育研究[5-9]、養殖技術研究[10-14]、營養學特征分析[2，15]、遺傳特征的微衛星分析等方面[16-17]，但對其同工酶的研究鮮見報道。

2.1.3 酯酶（EST 3.1.1.1）。

酯酶可在水分子的參與下，經由水解作用，將酯類切割成酸類與醇類。魚類的酯酶一般是單體酶或二聚體酶，由多個基因座位控制。試驗結果顯示：在雜交鱖F1代的5種組織中共檢測到15條酶帶（圖3），不同組織的 EST同工酶存在著基因座位的多態性，各組織的酶譜帶型分別為M7（13）、L63（11）945、K78231、H783、B78，帶型碼完全不同，呈現出較強的組織特異性。EST同工酶在肝臟、腎臟組織中的活性很高，且酶帶數很多;但在肌肉、腦組織中活性很低，且酶帶數最少。具體而言，EST4、EST5、EST6、EST9、EST11僅在肝臟中有特異表達，其中，EST6、EST11的活性較強;EST1、EST2僅在腎臟中表達，且EST2、EST3、EST7、EST8在腎臟中優勢表達;EST13僅在肌肉中表達。

2.2 雜交鱖F1[翹嘴鱖（♀）×斑鱖（♂）]與親本翹嘴鱖、斑鱖的3種組織同工酶譜比較

2.2.1 3種鱖魚的LDH酶譜比較。

對雜交鱖F1代和親本（斑鱖、翹嘴鱖）各自的3種組織（肌肉、肝臟、腎臟）同時進行了同工酶表達譜的比較試驗。結果表明：雜交鱖F1代與親本斑鱖、翹嘴鱖之間LDH同工酶譜存在明顯差異（圖4）。肌肉組織中均有LDH2條帶表達，活性較強，但翹嘴鱖還顯示出LDH4條帶;肝臟組織中LDH酶譜帶型差異顯著：雜交鱖LZ532，斑鱖LB35，翹嘴鱖LQ342，雜交鱖F1代相比斑鱖多了1條LDH2條帶，而相比翹嘴鱖少了1條LDH4酶帶、多了1條LDH5酶帶，表明雜交子代形成了雜合子，可作為鑒別3種鱖屬魚的生化標志;在腎臟中，3種鱖魚的LDH酶譜帶型分別為雜交鱖KZ235，斑鱖KB2345，翹嘴鱖KQ234，雜交鱖F1代缺少雙親的LDH4條帶，顯示出表達差異，而在3種鱖魚的腎臟中均呈現出LDH23酶譜帶型。

2.2.2 3種鱖魚的MDH酶譜比較。

從圖5可以看出，雜交鱖F1代的MDH表達在肌肉、肝臟中沒有表現出明顯差異，三者的肌肉MDH帶型碼均為M23，且表達水平普遍很低;肝臟MDH酶譜帶型均為L231，且條帶的相對活性一致;在腎臟中MDH酶譜帶型分別為雜交鱖KZ231，斑鱖KB23，翹嘴鱖KQ23，其中，雜交鱖的表達活性較高，而且相比雙親多了1個MDH1條帶，這些酶譜帶型可作為鑒定雜交鱖的依據之一。

2.2.3 3種鱖魚的EST酶譜比較。

從圖6可以看出，EST酶在3種鱖魚肌肉組織中的表達水平偏低，在肝臟、腎臟組織中表達水平較高。在肌肉組織中，雜交鱖F1代表達出雙親沒有的EST7條帶，具有與斑鱖相同的EST13酶帶，而翹嘴鱖沒有此酶帶;在肝臟組織中EST酶的酶譜帶型分別為雜交鱖LZ6（11）3945，斑鱖LB62（11）（14）（15）94（16）5，翹嘴鱖LQ27（12）（14）4（10）5，顯示出不同的譜型特征;雜交鱖F1代EST酶譜條帶少于雙親，但酶譜活性較高;在腎臟組織中EST酶的酶譜帶型也有差異，分別為雜交鱖KZ78231、斑鱖KB72、翹嘴鱖KQ732，雜交鱖F1代增加了雙親不具有的EST8和EST1酶帶，表達的相對活性與翹嘴鱖相近。

3 討論

3.1 影響同工酶試驗結果的幾個因素

聚丙烯酰胺凝膠電泳法包括制膠、制樣、加樣、電泳、染色等主要步驟，每一個步驟對測定結果都至關重要，若操作不當，則會出現酶帶分離效果不佳、有拖尾現象、酶失活導致無法染色等問題。筆者認為影響試驗結果的因素主要包括以下方面：①樣品中的脂肪影響。葛彥龍等[42]指出，酶帶出現拖尾現象極有可能是由樣品中的脂類造成的，可用氯仿脫脂以防止譜帶出現拖尾現象。②上樣緩沖液中蔗糖或甘油的影響。該部分試驗中，上樣緩沖液中添加了蔗糖，作用是保護同工酶。③上樣時樣品濃度的影響。點樣液中同工酶的濃度過低，則酶帶染色很淺，肉眼無法觀察到以致于被誤認為無條帶，故應根據具體的魚種類或組織調整點樣液中酶的濃度。④電壓大小的影響。應提高電泳電壓，防止擴散，同時縮短時間，但電壓過高、電流過大會產生熱量過大，造成酶的失活。⑤膠的濃度。應根據檢測的酶分子量大小選擇合適的膠濃度，濃度過高，最終酶的條帶過短，不利于觀察;濃度過低，則分離效果不佳。葛彥龍等[42]在采用更“劇烈的”試驗條件時，發現酶并沒有失活，這么操作實際上是使酶的活性降到最低，避免樣品中的酶會因為細胞破裂而相遇、互相降解。這與普遍認為的在樣品研磨處理時應該保持低溫、在電泳過程中也盡量保持溫和的條件不同。綜合以上幾個方面因素以及試驗操作，筆者認為在酶液提取時應動作迅速，脫脂后再進行電泳，且要避免將制好的樣品反復冷凍解凍;電泳時應選擇220 V電壓。分離膠濃度為8%時對EST同工酶分離效果較好，LDH、MDH同工酶的最適分離膠濃度則有待探索。至于在上樣緩沖液中添加蔗糖或甘油是否對酶有保護作用或是否會造成拖尾現象也應做進一步的對比分析研究。

3.2 斑鱖、翹嘴鱖同工酶圖譜

該研究中得出的斑鱖、翹嘴鱖同工酶圖譜與已有的研究報道存在某些差異。例如吳興兵等[49]報道太湖水域野生翹嘴鱖親魚繁殖后代肌肉中的LDH酶帶數為2，與該試驗結果一致。但楊軍峰等[50]報道武漢水域的翹嘴鱖肌肉中的EST酶帶數比斑鱖多1條，與該研究結果（斑鱖肌肉中的EST酶帶數比翹嘴鱖多1條）相反;另外，翹嘴鱖的腎臟EST酶譜結果顯示1條酶帶，而該研究結果顯示有3條酶帶;斑鱖的肝臟組織中LDH酶帶僅檢測到1條，此次試驗檢測出2條。究其原因，可能是種群之間有一定程度的遺傳分化。例如長江、珠江和黑龍江三水系的草魚（Ctenopharynodon idellus）種群之間存在明顯的生化遺傳差異[51]。表明同一種魚類的不同種群間既具有共同的酶譜特征，又具有一定的種群特異性，而且同一類群內不同個體間親緣關系的遠近也會影響基因座位的多態性，進而影響同工酶的表達。另一方面，即使同一種魚也會隨著生態環境的改變發生生理生化方面的改變。例如，香魚（Plecoglossus altivelis）因生活環境發生變化而形成了洄游型和陸封型2類，使兩者的LDH同工酶存在差異[52]。藍綠鱗鰓太陽魚（Lepomis cyanellus）體內乳酸脫氫酶和蘋果酸脫氫酶的活性水平會受到環境溫度變化響應而發生顯著變化[53]?？晌鼩馐胶粑拇澉k（Channa punctata）LDH同工酶的表達與是否接觸空氣有關[54]。通過該試驗結果與已有的研究報道[49-50，55-56]對比分析發現，酶譜特征比較穩定是翹嘴鱖肌肉LDH同工酶酶帶數為2，斑鱖腎臟LDH同工酶酶帶數為4，這一酶譜特征能可靠地用于種質鑒定。

3.3 雜交鱖F1[翹嘴鱖（♀）×斑鱖（♂）]同工酶圖譜

該研究首次報道了雜交鱖F1代5種組織的3種同工酶電泳圖譜，結果顯示，同工酶LDH和EST在各組織中的表達存在顯著差異，而同工酶MDH的表達差異不大。LDH5酶帶在雜交鱖F1代的肝臟中具有相對高的活性，而在其他組織中的相對活性低或不表達。LDH1酶帶僅在雜交鱖F1代的腦組織有特異性的表達，而在其他組織中未有表達。EST在雜交鱖F1代5種組織中的酶譜特征都不相同，存在明顯的組織表達特異性，表明該酶會根據不同組織的不同生理生化需要進行選擇性表達。而MDH在除了雜交鱖F1代肌肉組織以外的4種組織中的表達水平都較高，酶譜的相似度也較高，且帶型都比較簡單。

3.4 雜交鱖F1[翹嘴鱖（♀）×斑鱖（♂）]與親本翹嘴鱖、斑鱖的同工酶比較

同工酶表達的種質和組織特異性，與不同物種和器官組織的生理功能以及基因的調控有關。不同物種或種群之間存在著基因座位多態性，是劃分天然種群和亞種群的重要手段。通過同工酶分析可以了解不同物種基因表達與調控情況。對試驗結果分析后發現，雜交鱖F1代與親本斑鱖、翹嘴鱖的同工酶酶譜間既有聯系又存在差異，表明雜交鱖獲得了雙親的遺傳物質和生理生化性狀。例如，編碼乳酸脫氫酶亞基的3個基因通過分子雜交、2個位點的等位基因變體等方式顯示在魚體中[57]。將這3種鱖魚的同工酶酶譜表達特征用帶型碼描述匯總（表1），這些具有魚類種質特性的遺傳生化標志可用來作為這3種魚種質檢測的重要參考指標。表1中除了肝臟的EST同工酶帶型碼較復雜外，其余的同工酶帶型簡單明了，條帶清晰，種間差異明顯，是較為實用的遺傳性狀標志。

4 小結

該研究采用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測技術，首次開展了雜交鱖5個組織3種同工酶酶譜特征的研究，并對斑鱖、翹嘴鱖3個組織3種同工酶酶譜特征進行了比較研究與分析。結果表明：不同地理種群斑鱖、翹嘴鱖的個別同工酶圖譜存在一定的表達差異。雜交鱖F1代的3種同工酶具有不同程度的組織特異性，其中LDH同工酶、EST同工酶酶譜在5種組織中的表達特異性程度較高。雜交鱖F1代同工酶酶譜與雙親之間存在明顯的親緣關系和特異性，除了斑鱖和翹嘴鱖腎臟中的MDH同工酶譜以外，3個不同鱖種群間的酶譜特征均存在較明顯的種屬特異性，肝臟、腎臟中的LDH同工酶譜和EST同工酶譜、肌肉中的EST同工酶譜均存在顯著且穩定種屬差異表達。其中肝臟中EST同工酶譜較為復雜，其余的同工酶譜均簡單明了，條帶清晰穩定，種屬差異顯著，是較為實用的種質鑒定參考指標。通過分析斑鱖、翹嘴鱖及雜交鱖F1代的同工酶遺傳特性，為種質鑒定工作提供了具有較高價值的生化遺傳學資料，并為進一步開展斑鱖、翹嘴鱖的雜交育種工作提供了一定的理論支撐。

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