UPLC-QTOF-MS法分析沙棘果實、葉和枝的成分

鄭文惠，白海英，王麗瑤，包 芳，楊志剛

（蘭州大學藥學院，甘肅蘭州 730000）

沙棘Hippophae rhamnoidesL.為胡頹子科沙棘屬的落葉灌木或小喬木,含有鞣質類［1］、黃酮類［2］、萜類［3］、甾體類［4］、有機酸［5］和揮發油［5］等多種活性成分,具有較高的藥用價值。此外,沙棘在治理水土流失、改善生態環境和促進農民增收等方面發揮積極作用。

2015年版《中國藥典》 中沙棘以果實入藥,具有健脾消食、止咳祛痰、活血散瘀的功效。沙棘葉雖未被藥典收載,但具有抗氧化［1,6-7］、抗菌［7］、抗病毒［8］、抗炎［9］、抗癌［8］、抗肥胖［4］等生物活性,也是提取沙棘黃酮的重要原料。沙棘枝中含有三萜類化合物,具有抗炎和抗氧化活性［10］。目前,利用液質聯用技術（LC-MS）對沙棘果實和葉中酚類成分的研究較多［1,11-14］,課題組尚未發現采用LC-MS對沙棘枝進行化學成分研究的報道。為了促進沙棘不同部位的綜合開發利用,本研究對新疆產沙棘的果實中的化合物進行分離鑒定,并對沙棘果實、葉和枝的化學成分進行UPLC-QTOF-MS對比分析。

1 材料

Prep EasySep-1050半制備型高效液相色譜儀（中國上海通微分析技術有限公司）；半制備型色譜柱 Cosmosil 5C18-MS-Ⅱ、Cosmosil 5C18-PAQ、Cosmosil 5C18π NAP （10 mm×250 mm,5 μm,日本Nacalai tesque公司）；AVANCEⅢ-400型核磁共振波譜儀（德國Bruker公司）；薄層色譜用硅膠G和柱色譜硅膠（青島海洋化工有限公司）；D101型大孔吸附樹脂（北京Solarbio公司）；ODS （日本Nacalai tesque公司）；MCI Gel CHP-20 （日本三菱公司）；Sephadex LH-20葡聚糖凝膠（美國Ge公司）；Agilent 1290超高效液相色譜儀、Agilent 6560離子淌度飛行時間質譜儀（美國Agilent公司）；CORTECS UHPLC C18色譜柱 （2.1 mm ×100 mm,1.6 μm,美國Waters公司）；Ultrafree離心管（0.22 μm,美國Millipore公司）；質譜純甲醇和乙腈（美國Merda公司）；質譜純甲酸和水（德國Merck公司）；其余試劑均為分析純。

對照品pedunculagin、stachyurin、hippophaenin B、1,2,6-三-O-沒食子?；?β-D-吡喃型葡萄糖、木麻黃鞣亭、鞣花酸、槲皮素、異鼠李素、異鼠李素-3-O-槐糖-7-O-葡萄糖苷、異鼠李素-3-O-葡萄糖-7-O-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-蕓香糖苷、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷由課題組從沙棘中分離得到；異槲皮苷（批號RP170508,純度≥98%）、水仙苷（批號RP180814,純度≥98%）均購于成都麥德生科技有限公司。

本實驗所用沙棘于2017年9月采自新疆喀什,經蘭州大學楊志剛副教授鑒定為胡頹子科植物沙棘Hippophae rhamnoidesL.,標本保存于蘭州大學藥學院。

2 方法

2.1 提取與分離 新鮮沙棘果2.0 kg粉碎,石油醚脫脂,然后用3倍量80%乙醇浸泡提取,反復4次,每次2 h。紗布濾過并合并提取液,減壓濃縮至無乙醇味,得總浸膏470 g?？偨嗤ㄟ^D101型大孔樹脂柱粗分,以水-乙醇（100 ∶1～0 ∶100）梯度洗脫,得到9個部分（Fr.A～Fr.I）。

Fr.D （39.9 g）經過硅膠柱分離,以氯仿-甲醇-水（100 ∶1 ∶1～0 ∶100 ∶10）梯度洗脫,得到12個組分（Fr.D1～D12）。Fr.D9 （1.6 g）經開放ODS柱和半制備HPLC進行分離純化,得化合物1（10.0 mg）、2 （5.2 mg）。Fr.D10 （2.9 g）經開放ODS柱、硅膠柱、MCI柱、Sephadex LH-20柱和半制備HPLC進行分離純化,得化合物3（4.1 mg）、4 （10.6 mg）、5 （7.2 mg）。Fr.E（13.1 g）經過硅膠柱分離,用氯仿-甲醇（100 ∶1～0 ∶100）梯度洗脫,得化合物6 （23.3 mg）。

2.2 UPLC-QTOF-MS分析

2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取對照品pedunculagin、stachyurin、hippophaenin B、1,2,6-三-O-沒食子?；?β-D-吡喃型葡萄糖、異鼠李素-3-O-槐糖-7-O-葡萄糖苷、木麻黃鞣亭、鞣花酸、異鼠李素-3-O-葡萄糖-7-O-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-蕓香糖苷、異槲皮苷、水仙苷、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素、異鼠李素各1.00 mg,用甲醇水溶液溶解配成10 μg/mL的溶液,即得。

2.2.2 供試品溶液制備 將沙棘枝、葉和果實粉碎后過50目篩,分別稱取粉末0.2 g,置具塞錐形瓶中,加入20 mL 70%甲醇,超聲提取60 min。提取液靜置30 min,取上清液用離心過濾管3 000 r/min離心2 min,即得。

2.2.3 LC-MS條件 CORTECS UHPLC C18色譜柱（2.1 mm×100 mm,1.6 μm）；流動相0.1%甲酸水（A）-0.1%甲酸乙腈溶液（B）；梯度洗脫（0～2 min,7% B；2～3 min,7%～12% B；3～8 min,12%～18% B；8～12 min,18%～60% B；12～13 min,60%～100% B；13～14 min,100%B）；體積流量0.3 mL/min；柱溫36 ℃；進樣量2 μL。

質譜系統采用電噴霧離子源（ESI）；負離子檢測模式；掃描范圍m/z100～1 700。ESI源參數為干燥氣（N2）體積流量5 mL/min；干燥氣溫度300 ℃；霧化氣壓力35 psi （1 psi=6.895 kPa）；毛細管電壓3 500 V；噴嘴電壓1 000 V；毛細管出口電壓400 V；碰撞能20 eV。

3 結果

3.1 結構鑒定

化合物 1：黃色粉末,HR-ESI-MS m/z：623.161 9 ［M-H］-。1H-NMR （DMSO-d6,400 MHz） δ：12.57 （1H,s,5-OH）,7.84 （1H,d,J=1.6 Hz,H-2′）,6.90 （1H,d,J=8.4 Hz,H-5′）,7.51 （1H,dd,J=2.0,8.4 Hz,H-6′）,6.19 （1H,d,J=2.0 Hz,H-6）,6.41 （1H,d,J=2.0 Hz,H-8）,5.43 （1H,d,J=7.2 Hz,H-1″）,5.40 （1H,s,H-1?）,0.97 （3H,d,J=6.4 Hz,H-6?）,3.83 （3H,s,-OCH3）；13C-NMR（DMSO-d6,100 MHz） δ：156.5 （C-2）,133.0 （C-3）,177.3 （C-4）,161.2 （C-5）,98.8 （C-6）,164.4 （C-7）,93.9 （C-8）,156.5 （C-9）,104.0（C-10）,122.3 （C-1′）,115.3 （C-2′）,146.9 （C-3′）,56.2 （3′-OCH3）,149.4 （C-4′）,113.3 （C-5′）,121.1 （C-6′）,100.9 （Glc-C-1″）,74.3 （C-2″）,76.4 （C-3″）,68.3 （C-4″）,76.0 （C-5″）,66.9 （C-6″）,101.2 （Rha-C-1?）,70.3 （C-2?）,70.6 （C-3?）,71.8 （C-4?）,70.1 （C-5?）,17.7（C-6?）。以上數據與文獻［15］一致,故鑒定為檉柳黃素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-α-L-鼠李糖苷。

化合物 2：黃色粉末,HR-ESI-MS m/z：623.162 2 ［M-H］-。1H-NMR （DMSO-d6,400 MHz） δ：12.60 （1H,s,5-OH）,7.95 （1H,d,J=2.0 Hz,H-2′）,6.92 （1H,d,J=8.4 Hz,H-5′）,7.56 （1H,dd,J=2.0,8.8 Hz,H-6′）,6.45 （1H,d,J=2.0 Hz,H-6）,6.84 （1H,d,J=2.0 Hz,H-8）,5.57 （1H,d,J=7.6 Hz,H-1″）,5.56 （1H,s,H-1?）,1.11 （3H,d,J=6.0 Hz,H-6?）,3.84 （3H,s,-OCH3）；13C-NMR（DMSO-d6,100 MHz） δ：156.9 （C-2）,133.3 （C-3）,177.6 （C-4）,160.9 （C-5）,99.4 （C-6）,161.6 （C-7）,94.6 （C-8）,156.0 （C-9）,105.7（C-10）,120.9 （C-1′）,113.5 （C-2′）,147.0 （C-3′）,55.7 （3′-OCH3）,149.7 （C-4′）,115.3 （C-5′）,122.3 （C-6′）,100.7 （Glc-C-1″）,74.3 （C-2″）,77.5 （C-3″）,71.6 （C-4″）,76.4 （C-5″）,60.7 （C-6″）,98.3 （Rha-C-1?）,70.3 （C-2?）,70.1 （C-3?）,71.6 （C-4?）,69.9 （C-5?）,17.9（C-6?）。以上數據與文獻［16］一致,故鑒定為異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-α-L-鼠李糖苷。

化合物 3：白色粉末,HR-ESI-MS m/z：229.097 0 ［M-H］-。1H-NMR （DMSO-d6,400 MHz） δ：11.04 （1H,s,9-NH）,7.44 （1H,d,J=8.0 Hz,H-5）,7.33 （1H,d,J=8.0 Hz,H-8）,7.10 （1H,t,J=7.2,7.6 Hz,H-7）,7.01（1H,t,J=7.2,7.6 Hz,H-6）,4.56 （1H,d,J=6.4 Hz,H-1）,3.24 （1H,dd,J=4.4,16 Hz,H-4a）,3.15 （1H,s,H-3）,2.80 （1H,t,J=14 Hz,H-4b）,1.61 （3H,d,J=6.4 Hz,-CH3）；13C-NMR （DMSO-d6,100 MHz） δ：50.0（C-1）,58.4 （C-3）,23.5 （C-4）,118.9 （C-5）,120.0 （C-6）,122.6 （C-7）,112.1 （C-8）,131.8（C-10）,107.2 （C-4a）,126.6 （C-5a）,137.2（C-8a）,171.4 （-COOH）,17.34 （-CH3）。以上數據與文獻［17］一致,故鑒定為1-甲基-1,2,3,4-四氫咔啉-3-羧酸。

化合物 4：黃色粉末,HR-ESI-MS m/z：785.216 5 ［M-H］-。1H-NMR （DMSO-d6,400 MHz） δ：12.62 （1H,s,5-OH）,7.81 （1H,s,H-2′）,6.92 （1H,d,J=8.4 Hz,H-5′）,7.68（1H,d,J=7.6 Hz,H-6′）,6.44 （1H,s,H-6）,6.85 （1H,s,H-8）,5.74 （1H,d,J=5.2 Hz,H-1″）,4.62 （1H,d,J=7.6 Hz,H-1?）,5.56 （1H,s,H-1″″）,1.11 （3H,d,J=6.0 Hz,H-6?）,3.85 （3H,s,-OCH3）；13C-NMR （DMSOd6,100 MHz） δ：156.6 （C-2）,133.3 （C-3）,177.7 （C-4）,161.0 （C-5）,99.5 （C-6）,161.7（C-7）,94.7 （C-8）,156.0 （C-9）,105.7 （C-10）,120.8 （C-1′）,113.1 （C-2′）,147.3 （C-3′）,55.9 （3′-OCH3）,150.2 （C-4′）,115.5 （C-5′）,123.2 （C-6′）,98.4 （Glc-C-1″）,82.1 （C-2″）,76.6 （C-3″）,69.6 （C-4″）,76.7 （C-5″）,60.6 （C-6″）,103.6 （Glc-C-1?）,74.4 （C-2?）,76.9 （C-3?）,70.2 （C-4?）,77.5 （C-5?）,60.9（C-6?）,98.3 （Rha-C-1″″）,69.9 （C-2″″）,70.4（C-3″″）,71.7 （C-4″″）,69.9 （C-5″″）,18.0 （C-6″″）。以上數據與文獻［16］一致,故鑒定為異鼠李素-3-O-β-D-槐二糖-7-O-α-L-鼠李糖苷。

化合物 5：黃色粉末,HR-ESI-MS m/z：609.146 8 ［M-H］-。1H-NMR （DMSO-d6,400 MHz） δ：12.59 （1H,s,5-OH）,7.53 （1H,s,H-2′）,6.84 （1H,d,J=8.0 Hz,H-5′）,7.55（1H,m,H-6′）,6.19 （1H,d,J=2.0 Hz,H-6）,6.38 （1H,d,J=1.6 Hz,H-8）,5.34 （1H,d,J=6.8 Hz,H-1″）,4.38 （1H,s,H-1?）,0.99 （3H,d,J=6.4 Hz,H-6?）；13C-NMR（DMSO-d6,100 MHz） δ：156.4 （C-2）,133.3 （C-3）,177.4 （C-4）,161.2 （C-5）,98.7 （C-6）,164.1 （C-7）,93.6 （C-8）,156.6 （C-9）,104.0（C-10）,121.6 （C-1′）,115.2 （C-2′）,144.8 （C-3′）,148.4 （C-4′）,116.3 （C-5′）,121.2 （C-6′）,100.8 （Rha-C-1″）,74.1 （C-2″）,76.5 （C-3″）,70.6 （C-4″）,75.9 （C-5″）,68.3 （C-6″）,101.2 （Glc-C-1?）,70.0 （C-2?）,70.4 （C-3?）,71.9 （C-4?）,67.0 （C-5?）,17.8 （C-6?）。以上數據與文獻［18］一致,故鑒定為蘆丁。

化合物 6：黃色粉末,HR-ESI-MS m/z：477.104 3 ［M-H］-。1H-NMR （DMSO-d6,400 MHz） δ：7.95 （1H,d,J=2.0 Hz,H-2′）,7.49（1H,dd,J=2.0,8.8 Hz,H-6′）,6.92 （1H,d,J=8.0 Hz,H-5′）,6.45 （1H,d,J=2.4 Hz,H-8）,6.21 （1H,d,J=2.0 Hz,H-6）,5.58（1H,d,J=7.2 Hz,H-1?）,3.84 （3H,s,-OCH3）；13C-NMR （DMSO-d6,100 MHz） δ：156.4（C-2）,133.0 （C-3）,177.4 （C-4）,161.2 （C-5）,98.7 （C-6）,164.2 （C-7）,93.7 （C-8）,156.3 （C-9）,104.0 （C-10）,121.1 （C-1′）,113.5 （C-2′）,146.9 （C-3′）,55.7 （3′-OCH3）,149.4 （C-4′）,115.2 （C-5′）,122.0 （C-6′）,100.8 （Glc-C-1″）,74.3 （C-2″）,77.5 （C-3″）,69.8 （C-4″）,76.4 （C-5″）,60.6 （C-6″）。以上數據與文獻［19］一致,故鑒定為異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷。

3.2 沙棘不同部位成分分析 利用UPLC-QTOFMS對新疆產沙棘枝、葉和果實進行化學成分分析,通過與對照品以及相關文獻報道的質譜數據進行分析對比,得到38個峰的保留時間和質譜信息,鑒定出30個化合物,見表1。新疆產沙棘枝、葉和果實提取物的總離子流圖,見圖1。

峰1、6、9、14、17、18、21、22、24、26、28、29、32、35,與對照品的保留時間和離子碎片信息相同,分別被鑒定為pedunculagin、stachyurin、hippophaenin B、1,2,6-三-O-沒食子?；?β-D-吡喃型葡萄糖、異鼠李素-3-O-槐糖-7-O-鼠李糖苷、木麻黃鞣亭、鞣花酸、異鼠李素-3-O-葡萄糖-7-O-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-蕓香糖苷、異槲皮苷、水仙苷、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素、異鼠李素。

峰2為B型二聚體原花青素。由準分子離子峰m/z577.137 4 ［M-H］-,推斷其分子式為C30H26O12,MS/MS譜圖中有明顯的Retro-Diels-Alder （RDA）重排產生的m/z289 ［M-H-289］-,407 ［M-H-170］-,425 ［M-H-152］-碎片離子信息,與文獻［19-20］報道的B型二聚體原花青素的特征性離子碎片一致。

峰3為兒茶酸。由準分子離子峰m/z289.072 3［M-H］-,推斷其分子式為C15H14O6,以m/z289.072 3作為母離子進行二級質譜分析,譜圖中有明顯的m/z125,179,203,245碎片離子信息,故鑒定為兒茶酸［20-21］。

峰5是沒食子?；?六羥基聯苯甲?；?葡萄糖。由準分子離子峰m/z633.074 8 ［M-H］-,推斷其分子式為C27H22O18。MS/MS譜圖中有明顯的m/z275,301,463碎片離子信息,與文獻所報道的沒食子?；?六羥基聯苯甲?；?葡萄糖的特征性離子碎片一致［22］。

表1 沙棘不同部位化合物UPLC-QTOF-MS檢測結果Tab.1 Detection results of compounds in different parts of H.rhamnoidesby UPLC-QTOF-MS

峰7為槲皮素-3,7-二-O-葡萄糖苷。由準分子離子峰m/z625.143 7 ［M-H］-,推斷其分子式為C27H30O17。在其二級質譜譜圖中,發現進一步產生的m/z301,463碎片離子,其中碎片463 ［MH-162］-是母離子丟失1分子葡萄糖,丟失2分子葡萄糖得到碎片301 ［M-H-162-162］-,故鑒定為槲皮素-3,7-二-O-葡萄糖苷［23］。

峰10為槲皮素-3-O-槐糖-7-O-鼠李糖苷。由準分子離子峰m/z771.201 5 ［M-H］-,推斷其分子式為C33H40O21。在MS/MS譜圖中,有明顯的m/z179,301,447,625碎片離子。由母離子丟失1分子鼠李糖產生碎片離子625 ［M-H-146］-,母離子丟失1分子槐糖產生碎片離子447 ［M-H-324］-,苷元槲皮素的碎片離子301 ［M-H-146-324］-經過RDA重排產生碎片179,故推測其為槲皮素-3-O-槐糖-7-O-鼠李糖苷［24］。

圖1 圖1沙棘不同部位總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatogram of different parts of H.rhamnoides

峰12是表兒茶酸。由準分子離子峰m/z289.072 1 ［M-H］-,推斷其分子式為C15H14O6,與峰3互為同分異構體。以m/z289.072 1作為母離子進行二級質譜分析,譜圖中有明顯的m/z125,179,203,245碎片離子信息,與文獻［20］報道的表兒茶酸的特征性離子碎片一致。

峰15為山柰酚-3-O-槐糖-7-O-鼠李糖苷。由準分子離子峰m/z755.207 6 ［M-H］-,推斷其分子式為C33H40O20。在二級質譜譜圖中,其進一步產生m/z285,431,609碎片離子。碎片離子609［M-H-146］-由母離子丟失1分子鼠李糖,碎片離子431 ［M-H-324］-由母離子丟失1分子槐糖,碎片離子285 ［M-H-146-324］-為母離子丟失1分子鼠李糖和1分子槐糖,與文獻［24］報道的山柰酚-3-O-槐糖-7-O-鼠李糖的特征性離子碎片一致。

峰16是槲皮素-7-O-葡萄糖苷。由準分子離子峰m/z463.053 8 ［M-H］-,推斷其分子式為C21H20O12,MS/MS譜圖中有明顯的由母離子丟失1分子葡萄糖形成m/z301 ［M-H-162］-碎片離子,故推測其為槲皮素-7-O-葡萄糖苷［24］。

峰19為槲皮素-3-O-葡萄糖-7-O-鼠李糖苷。由準分子離子峰m/z609.149 6 ［M-H］-,推斷其分子式為C27H30O16,在隨后的二級質譜裂解過程中,發現其進一步產生m/z151,301,447,463碎片離子。 m/z463 ［M-H-146］-是母離子丟失1分子鼠李糖,m/z447 ［M-H-162］-為母離子丟失1分子葡萄糖,m/z301 ［M-H-146-162］-經過經RDA重排產生碎片離子151,與文獻［23］報道的槲皮素-3-O-葡萄糖-7-O-鼠李糖苷的特征性離子碎片一致。

峰20為鞣花酸-戊糖苷。由準分子離子峰m/z433.043 ［M-H］-,推斷其分子式為C19H14O12,MS/MS譜圖中m/z301 ［M-H-132］-由母離子丟失1分子戊糖形成,推測為鞣花酸-戊糖苷［22］。

峰23是異鼠李素-蕓香糖-鼠李糖苷。由準分子離子峰m/z769.222 6 ［M-H］-,推斷其分子式為C34H42O20,以m/z769.222 6作為母離子進行二級質譜分析,發現母離子丟失1分子鼠李糖的碎片離子623 ［M-H-146］-,以及繼而丟失1分子蕓香糖得碎片離子315 ［M-H-146-308］-。

峰26為山柰酚-3-O-蕓香糖苷。由準分子離子峰m/z593.153 7 ［M-H］-,推斷其分子式為C27H30O15,在二級質譜譜圖中可見由母離子丟失1分子蕓香糖形成的m/z285 ［M-H-308］-,故推測為山柰酚-3-O-蕓香糖苷［2］。

峰29為槲皮素-7-O-鼠李糖苷。由準分子離子峰m/z447.095 3 ［M-H］-,推斷其分子式為C21H20O11,以m/z447.095 3作為母離子進行二級質譜分析,譜圖中有明顯的m/z151,301碎片離子信息。碎片離子301 ［M-H-146］-為母離子丟失1分子鼠李糖,再經過RDA重排后產生碎片151。與文獻［24］所報道的槲皮素-7-O-鼠李糖苷的特征性離子碎片一致。

峰30是山柰酚-3-O-葡萄糖鼠李糖苷。由準分子離子峰m/z593.131 7 ［M-H］-,推斷其分子式為C27H30O15,在二級質譜譜圖中有明顯的m/z151,285,447碎片離子信息。碎片離子447 ［MH-146］-由母離子丟失1分子鼠李糖得到,繼而丟失1分子葡萄糖得到285 ［M-H-146-162］-,碎片離子285經過RDA重排產生m/z151。與文獻［24］所報道的山柰酚-3-O-葡萄糖鼠李糖苷的特征性離子碎片一致。

峰32為異鼠李素-鼠李糖苷。由準分子離子峰m/z461.110 7 ［M-H］-,推斷其分子式為C33H22O11,以m/z461.110 7作為母離子進行二級質譜分析,譜圖中有明顯的m/z107,151,300,315碎片離子信息。母離子丟失1分子鼠李糖得到碎片離子315 ［M-H-146］-,繼而丟失-CH3得到碎片離子300,碎片離子151和107為苷元異鼠李素m/z315經過RDA重排產生。

4 討論

本研究從新疆產沙棘果實中分離鑒定了6個化合物,其中化合物3為首次從沙棘屬植物中分離得到。此外,采用UPLC-QTOF-MS對新疆產沙棘枝、葉和果實的化學成分進行快速分析,共鑒定或推斷出30個化合物,包括8個鞣質類和22個黃酮類,其中在枝中未檢出hippophaenin B,表兒茶酸則在葉中未被檢出,沒食子?；?六羥基聯苯甲?；?葡萄糖、槲皮素-二葡萄糖苷、hippophaenin B、木麻黃鞣亭在果實中未被檢出。以期本研究為進一步對新疆沙棘進行活性化學成分開發和利用提供參考。