基于網絡藥理學探討行氣活血通絡方治療神經根型頸椎病的作用機制

賀 豐，朱立國*，趙 赫，付玲玲，李學朋

（1.中國中醫科學院望京醫院，北京 100102；2.清華大學材料學院，北京 100084；3.北京中醫藥大學東直門醫院，北京 100700）

神經根型頸椎病是一種較為常見的神經系統功能障礙性疾病,常由頸部脊髓神經根受到機械壓迫或因神經根周圍組織受損釋放炎性因子刺激導致,如間盤退變椎間孔變窄、椎間關節活動度減小、鉤突關節增生等［1］。Radhakrishnan等［2］研究表明50～54歲年齡組每10萬人的年發病率最高可達202.9,隨著電腦、智能手機的普及和伏案工作時間增長,發病率逐漸增高,而且發病年齡逐漸年輕化。中醫學認為本病屬于“項痹” 范疇,內因氣血不足,不能濡養筋骨,外加勞累,起居不慎,風寒濕邪入侵,壅閉經絡,導致氣血凝滯、經絡不通而產生疼痛、麻木等癥狀［3］。神經根型頸椎病以上肢疼痛,受累神經根支配區域感覺異常、肌力減退甚至肌肉萎縮為典型癥狀,嚴重影響人們的生活質量。其治療方法主要以非手術療法為主,西醫包括頸部制動、牽引、理療、抗炎、神經根脫水、硬膜外激素注射等［4］。而中醫治療神經根型頸椎病具有獨特優勢,包括針灸、手法、拔罐、中藥外敷、小針刀、中藥方劑辨證施治等。其中,辨證后使用方劑治療神經根型頸椎病是一種別具特色且效果良好的方法。

行氣活血通絡方,是中國中醫科學院望京醫院院內制劑,由三七、川芎、延胡索、秦艽、獨活、桂枝、葛根、威靈仙、當歸、白芍、地龍11味中藥組成,具有活血通絡、行氣止痛之效。其中,川芎、延胡索活血行氣、散郁止痛共為君藥。白芍,養血合營、緩急止痛；當歸、地龍補血活血、通經活絡,主肢體麻木,半身不遂；桂枝、葛根溫經通脈,善治頸項肢節強痛,上5味共為臣藥。秦艽、威靈仙、獨活祛風除濕,和血舒筋,通絡止痛,主風濕痹痛,肢麻筋攣,頭項難伸共為佐藥；三七活血消腫、祛瘀止痛為使藥。諸藥合用化瘀行氣、通絡止痛,治療神經根型頸椎病臨床效果顯著。目前的研究多通過臨床療效或動物實驗探討行氣活血通絡方作用機制,對其藥效物質基礎及分子水平作用機制等方面研究尚不明確。并且由于復方中藥活性成分多樣,可作用于不同靶點,所以用常規方法來描述此方治療神經根型頸椎病藥理學機制則顯得比較困難。

網絡藥理學是基于藥物通過“多靶點、多途徑、多通路” 發揮作用的理念而發展起來的新方法［5］,它可整合各種藥物、蛋白、基因等數據庫,采用生物信息學技術分析和構建藥物-靶點-疾病的網絡相互作用模型,探索藥物發揮作用機制,其整體性、系統性的特點非常適合應用于中藥及中藥復方的研究。本研究采用網絡藥理學方法對行氣活血通絡方治療神經根型頸椎病的機制進行探討,并為中藥復方的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 行氣活血通絡方所含成分的收集與篩選 行氣活血通絡方由11味中藥組成,分別是三七、川芎、延胡索、秦艽、獨活、桂枝、葛根、威靈仙、當歸、白芍、地龍。通過國內外文獻調研和中藥系統藥理學數據庫分析平臺TCMSP （https：//tcmspw.com/tcmsp.php）收集以上11味中藥的活性成分,因地龍未在TCMSP中收錄,因此通過BATMAN-TCM （http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）數據庫檢索其活性成分,然后將地龍活性成分輸入TCMSP數據庫進行檢索,最后以口服生物利用度（oral bioavailability,OB）≥30% 和類藥性 （drug-likeness,DL）≥0.18［6］為限定條件對所有活性成分進行篩選。

1.2 行氣活血通絡方成分靶點預測 通過TCMSP數據庫檢索“1.1” 項中篩選出的活性成分的相關蛋白靶點,由于檢索到的蛋白靶點存在命名不規范的問題,因此使用UniProt數據庫（https：//www.uniprot.org/）中的UniprotKB搜索功能,通過輸入靶點名稱并設定物種為人,將檢索到的所有靶點蛋白校正為其官方基因名稱（Official Symbol）。

1.3 神經根型頸椎病相關基因靶點的篩選 通過GeneCards數據庫 （http：//www.genecards.org,Version 4.5.0）、OMIM數 據 庫 （https：//omim.org/）和DisGeNET數據庫（http：//www.disgenet.org）檢索與神經根型頸椎病相關基因。因為神經根型頸椎病屬于周圍神經損傷,為了使結果更加全面準確,因此分別使用檢索詞peripheral nerve injury、cervical radiculopathy進行檢索,獲取與神經根型頸椎病相關基因。

1.4 行氣活血通絡方活性成分靶點與神經根型頸椎病相關靶點相互作用網絡構建與分析 利用R語言韋恩圖將行氣活血通絡方活性成分靶點基因與神經根型頸椎病相關基因進行合并,交集的部分很有可能是行氣活血通絡方活性成分治療神經根型頸椎病的靶點基因。將交集基因及與之對應化合物導入Cytoscape 3.6.0軟件構建行氣活血通絡方活性成分-作用靶點網絡,并對網絡進行分析,保存網絡分析結果。在網絡中,用節點（node）表示成分和靶點,用邊（edge）表示成分與靶點之間的相互作用。

1.5 蛋白相互作用網絡構建與分析 STRING數據庫（https：//string-db.org,Version 10.5）［7］是一個收集了大量蛋白相互作用關系的數據庫,其中包含了經過實驗驗證和通過生物信息學方法預測得到的數據,共涉及9 643 763個蛋白,1 380 838 440個相互作用。將行氣活血通絡方活性成分作用的蛋白靶點導入STRING數據庫,限定物種為人,獲取蛋白相互作用關系,結果保存成TSV格式,導入Cytoscape 3.6.0軟件繪制相互作用網路。首先對此蛋白互作網絡進行總體分析,然后使用Cytoscape 3.6.0軟件中的cytohubba插件確定最重要的10個蛋白互作關系,計算方法的選擇最大團中心性（maximal clique centrality,MCC）［8］。

1.6 GO分析與KEGG通路分析 Metascape數據庫（http：//metascape.org）可為大規模的基因或蛋白提供系統綜合的生物功能注釋信息,能夠找出最顯著富集的生物學注釋［9］。將行氣活血通絡方的作用靶點導入Metascape數據庫,Input as species和Analysis as species均設置為H.sapiens,選擇自定義分析（Custom Analysis）中的富集（Enrichment）,分別對GO Biological Processes、GO Molecular Functions、GO Cellular Components、KEGG Pathway進行富集分析（Enrichment Analysis）,保存結果,篩選排名靠前條目。GO分析用GraphPad Prism 7.0軟件繪制條形圖、KEGG Pathway,用R語言繪制氣泡圖。

2 結果

2.1 行氣活血通絡方成分的收集與篩選 通過TCMSP數據庫,以OB≥30%和DL≥0.18為參數收集行氣活血通絡方中符合條件的活性成分,結果三七8種、川芎8種、延胡索49種、秦艽2種、獨活9種、桂枝7種、葛根4種、威靈仙7種、當歸2種、白芍13種；地龍在BATMAN-TCM數據庫中檢索到8種活性成分,代入TCMSP數據庫后,滿足篩選條件的1種。所有化合物去重后共得到93種活性成分。

2.2 行氣活血通絡方靶點預測 通過TCMSP數據庫檢索行氣活血通絡方所含93種活性成分,結果得到出784個靶點,其中三七54個、川芎45個、延胡索215個、秦艽40個、獨活92個、桂枝52個、葛根69個、威靈仙53個、當歸70個、白芍90個、地龍4個。去重后共得到250個靶點,通過UniProt數據庫將靶點蛋白轉換為官方名稱（Officical Symbol）。

2.3 神經根型頸椎病相關基因靶點篩選 在數據庫中以peripheral nerve injury、cervical radiculopathy進行檢索后,分別獲得5 025、79個相關基因靶點,刪除重復后共得到5 041個神經根型頸椎病相關基因。

2.4 行氣活血通絡方活性成分-作用靶點網絡互作 將“2.2” “2.3” 項中的基因進行映射對比,發現213個共同基因,見圖1,推測這些可能為行氣活血通絡方治療神經根型頸椎病的基因靶點。將交集基因靶點與對應活性成分輸入Cytoscape 3.6.0軟件構建行氣活血通絡方活性成分-作用靶點網絡,見圖2。圖中共涉及303個節點,1 239條邊,其中菱形節點代表行作用靶點,圓形代表活性成分,邊代表活性成分和作用靶點間的相互關聯。從圖中可看出同一靶點可對應于不同的活性成分,同一活性成分也可對應于不同的靶點,體現了行氣活血通絡方多成分、多靶點的作用特點。其中川芎、延胡索共有成分槲皮素（quercetin/133個靶點）,白芍獨有成分山柰酚（kaempferol/52個靶點）,葛根獨有成分芒柄花黃素（formononetin/34個靶點）是作用靶點最多3種化合物。β-谷甾醇（beta-sitosterol/33個靶點）作用靶點數目排名第4,但當歸、白芍、獨活、三七、秦艽、桂枝、葛根、威靈仙8味藥中都含有此種成分。因此,上述4種化合物可能是此方劑中比較重要的活性成分。

2.5 蛋白相互作用網絡構建與分析 蛋白互作網絡結果見圖3,圖中節點表示蛋白,邊表示蛋白之間的關聯,共涉及210個節點,3 721條邊（其中ADH1C、ATP5F1B未在數據庫中找到,EIF6與其他蛋白沒有相互作用,這3個蛋白不在相互作用網絡中體現）。使用cytohubba插件中MCC方法計算后,確定最重要的10個蛋白互作關系,結果見圖4。

圖1 行氣活血通絡方化合物相關靶點與神經根型頸椎病相關靶點映射

圖2 行氣活血通絡方“活性成分-靶點” 相互作用網絡圖

圖3 蛋白互作網絡

2.6 基因功能分析 使用Metascape數據庫對行氣活血通絡方活性成分對應靶點進行GO分析,并篩選靠前的生物學過程、分子功能和細胞組分,用GraphPad Prism 7.0軟件繪圖,見圖5～7。

圖4 10個最重要的蛋白互作關系

其中BP分析（圖5）中排名靠前的有response to toxic（對有毒物質的反應,65個靶點/30.66%）、response to inorganic substance （對無機物的反應,61個靶點/28.77%）、cellular response to nitrogen compound （細胞對氮化合物的反應,59個靶點/27.83%）、cellular response to organic cyclic compound （細胞對有機環狀化合物的反應,56個靶點/26.42%）、response to lipopolysaccharide （對脂多糖的反應,44個靶點/20.75%）等生物學過程。MF分析（圖6）排名靠前的的有neurotransmitter receptor activity （神經遞質受體活性,22個靶點/10.38%）、kinase binding （激酶結合,39個靶點/18.4%）、G protein-coupled amine receptor activity（G蛋白偶聯胺受體活性,15個靶點/7.08%）、transcription factor binding （轉錄因子結合,35個靶點/16.51%）、protein domain specific binding （蛋白域特異性結合,34個靶點/16.04%）等分子功能。CC分析（圖7）排名靠前的有membrane raft （膜筏,31個靶點/14.62%）、postsynaptic membrane （突觸后膜,26個靶點/12.26%）、dendrite （樹突,32個靶點/15.09%）、receptor complex （受體復合物,26個靶點/12.26%）、vesicle lumen （囊腔,19個靶點/8.96%）等細胞組分。

圖5 GO分析生物學過程

圖6 GO分析分子功能

圖7 GO分析細胞組分

2.7 KEGG通路分析 使用Metascape數據庫對行氣活血通絡方治療神經根型頸椎病的213個靶點進行KEGG通路分析,根據LogP值篩選靠前的10個代表性通路見圖8。圖中節點的顏色從綠到紅反應了LopP值從大到小,節點從小到大反應了相關基因數量的從少到多。結果顯示,行氣活血通絡方治療神經根型頸椎病的機制主要涉及AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、Pathways in cancer、TNF signaling pathway、Neuroactive ligand-receptor interaction、HTLV-I infection、MAPK signaling pathway、Platinum drug resistance、cAMP signaling pathway、NF-kappa B signaling pathway、Amoebiasis等通路。因此推測行氣活血通絡方治療神經根型頸椎病可能與上述通路關系密切。

3 討論

神經根型頸椎是頸椎病分型中的一種,以放射性上肢疼痛麻木或上肢感覺、運動功能障礙為主要表現。中藥治療頸椎病一般采取祛風散寒、活血行氣、化痰祛濕、補益肝腎、通絡止痛等治療方法。行氣活血通絡方,是中國中醫科學院望京醫院院內協定方,由三七、川芎、延胡索、秦艽、獨活、桂枝、葛根、威靈仙、當歸、白芍、地龍11味中藥組成。方中川芎、延胡索活血行氣、散郁止痛共為君藥。白芍,合營止痛；當歸、地龍活血通絡；桂枝、葛根溫經通脈,上5味共為臣藥。秦艽、威靈仙、獨活祛風除濕,通絡止痛,共為佐藥；三七活血消腫、祛淤止痛為使藥。諸藥合用活血行氣、通絡止痛,臨床采用此方加減治療神經根型頸椎病具有良好療效,以此方為基礎化裁出的頸痛顆粒,已經批準上市用于治療神經根型頸椎?。?0］。但行氣活血通絡方治療神經根型頸椎病的藥理學機制尚不明確。

圖8 行氣活血通絡方治療神經根型頸椎病相關靶點KEGG通路富集

本研究利用網絡藥理學方法從行氣活血通絡方所含11味中藥中,篩選出93種活性成分,250個基因靶點,其中有213個基因與神經根型頸椎病相關,構建行氣活血通絡方活性成分-作用靶點網絡圖,有303個節點,1 239條邊。顯示了行氣活血通絡方多成分、多靶點共同作用治療神經根型頸椎病的特點。其中槲皮素是行氣活血通絡方中君藥川芎、延胡索的共有成分,擁有133個作用靶點在所有化合物中排名第1。臣藥白芍的化合物山柰酚、葛根的化合物芒柄花黃素分別作用于52、44個靶點位列第2、3位,間接說明了君、臣藥在此方中的重要作用。而第4位的β-谷甾醇（beta-sitosterol/33個靶點）是當歸、白芍、獨活、三七、秦艽、桂枝、葛根、威靈仙8味中藥的共有化合物,說明此方劑組合可產生一定的協同作用。以上兩點可反應此方配伍較為科學合理。槲皮素是一種廣泛存在于自然界的天然黃酮類化合物,目前已經發現它具有多重生物活性,如抗氧化、抗病毒、抗炎作用［11］。Lazo-Gomez等［12］研究表明,槲皮素可通過活化sirtuin 1 （去乙?；福┓乐孤耘d奮毒性刺激引起的脊髓運動神經元退行性變。Chen等［13］研究表明槲皮素可通過調節與再生和營養支持有關的基因的表達,如增加環磷酸腺苷表達使神經細胞在外周神經軸突再生中的生長激活,促進軸突再髓化,運動神經傳導速度加快,從而促進小鼠坐骨神經擠壓損傷后運動和感覺功能的恢復。山柰酚是一種黃酮類化合物,具有明顯的抗氧化和抗炎活性。Su等［14］研究表明,山柰酚通過抑制NADPH氧化酶和保護SHP-2 （酪氨酸磷酸酶）免受氧化失活抑制膠原誘導的血小板活化,這說明山柰酚具有預防和治療血栓性血管疾病的治療潛力。農藥毒死蜱（Chlorpyrifos,CPF）,是一種潛在的食品污染物,會引起神經毒性,Hussein等［15］研究表明,山柰酚可能通過調節GSK3β-Nrf2 （糖原合成酶激酶3β-核因子E2相關因子）信號通路,抑制GSK3β 介導基因表達和誘導Nrf2在大腦組織表達,提高抗氧化酶活性和乙酰膽堿酯酶活性,起到對神經元損傷的保護作用。芒柄花黃素可抑制腦內炎癥反應和氧化應激,從而起到對腦外傷大鼠的神經保護作用［16］。β-谷甾醇廣泛地存在于多種植物的細胞膜中,藥理活性多樣,研究表明,β-谷甾醇可調控多種細胞信號通路,包括細胞周期、凋亡、增殖、存活、侵襲、血管生成、轉移和炎癥［17］。

蛋白相互作用網絡結果顯示行氣活血通絡方作用于神經根型頸椎病的靶點間存在著復雜的交互關系,而不是獨立的發揮作用,網絡中共有210個節點,3 721條邊,經過計算后發現JUN （轉錄因子AP-1）、VEGFA （血管內皮生長因子A）、TP53 （腫瘤抑制蛋白）、AKT1 （蛋白激酶B）、MAPK1 （絲裂原激活的蛋白激酶1）、BCL2 （細胞凋亡相關蛋白）、PIK3CG （磷脂酰肌醇3激酶）、IL-6 （白細胞介素6）、PTGS2 （前列腺素內過氧化物合酶）、MMP9 （基質金屬蛋白酶9）等可能是行氣活血通絡方治療神經根型頸椎病的主要靶蛋白。GO富集分析發現,行氣活血通絡方治療神經根型頸椎病主要涉及毒性反應、無機物反應、細胞對氮化合物的反應、細胞對有機循環化合物的反應、脂多糖反應、細胞對藥物的反應、細胞因子介導的信號通路、氧水平反應、類固醇激素反應、活性氧代謝等生物學過程；涉及神經遞質受體的活性、激酶結合、G蛋白偶聯胺受體活性、轉錄因子結合、蛋白質結構域特異性結合、蛋白異構化活性、核受體活性、突觸后神經遞質受體活性、受體調節活性、蛋白酶結合等分子功能；涉及膜筏、突觸后膜、樹突、受體復合體、囊泡腔、轉錄因子復合體、胞質核周區、細胞頂部、樹突膜等細胞組分,是一個復雜的過程。

通過KEGG生物途徑富集分析發現,有10條信號通路被顯著富集。其中,腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor,TNF）信號通路,可誘導多種細胞內信號傳導,包括凋亡、細胞存活、炎癥和免疫Rothman等［18］研究發現大鼠頸背根神經節受壓可產生疼痛,而TNF-α 抗體可阻斷相關信號傳導提高痛閾。NF-κB （nuclear factor-kappa B,NF-κB）是一個轉錄因子家族的通稱,可調控涉及免疫、炎癥和細胞存活的基因。Suzuki等［19］發現使用NF-κB拮抗劑可明顯抑制大鼠受壓背根神經節中轉錄激活因子3 （ATF-3）及降鈣素基因相關肽（CGRP）基因表達,從而提高大鼠的機械性痛閾和熱覺痛閾,同時也證明NF-κB可能是腰椎間盤突出引起的坐骨神經痛明確的治療靶點。晚期糖基化終末產物與其受體（AGEs-RAGE）是一組特異性組合,AGEs的產生和蓄積是導致神經、血管等多組織器官損傷的重要病理基礎［20］。AGEs與RAGE相互作用啟動一系列受體信號轉導途徑,激發多種細胞因子的形成與釋放,導致機體神經、血管的病理改變。AGEs與RAGE的相互作用還可導致氧化應激的發生,進而激活NF-κB。NF-κB的激活可以增加黏附因子、內皮素和促凝血組織因子等基因的表達,使血流調節受損,導致神經內膜血流灌注減少［21］。神經活性配體-受體相互作用是質膜上所有與細胞內外信號通路相關的受體和配體的集合。涉及環境信息處理,信號分子間相互作用等功能。人T細胞白血病病毒1型（HTLV-1）是一種致病性逆轉錄病毒,除了成人T細胞白血病/淋巴瘤（ATL）有關,它還與非腫瘤性慢性炎性疾病密切相關,Tax是此通路中一種病毒調控蛋白和轉錄輔助因子,可干擾與抗凋亡或細胞增殖相關的多個信號通路,Tax調控信號通路也可涉及到它的結合轉錄因子如NF-κB等［22］。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）級聯是一個高度保守的模塊,參與細胞的增殖、分化和遷移等多種功能。Obata等［23］研究表明MAPK在初級傳入神經的活化作用,可能與炎癥誘導的神經根病變的病理生理機制相關,初級傳入神經中的MAPK通路,可能是背根神經節體細胞附近由炎性引起的神經病理性疼痛潛在的藥物干預靶點。環腺苷酸信號通路（cAMP signaling pathway,cAMP）是最常見、最普遍的第二信使之一,它的形成是由腺苷酰環化酶（AC）在G蛋白偶聯受體（GPCRs）被激素、神經遞質等信號分子配體連接后激活而促進的。細胞內cAMP水平的改變會影響細胞內信號轉導通路,進而調節蛋白活性、基因表達和細胞功能,進而調節細胞代謝、生長、分化和凋亡［24］。據報道［25］,神經組織中cAMP水平的升高不僅有助于減少SCI后的繼發性病理反應,還能促進神經再生。Yang等［26］研究表明,補陽還五湯聯合骨髓間充質干細胞移植對脊髓損傷后紅核神經元的神經保護具有協同作用,其機制可能與上調cAMP水平、激活cAMP/CREB/RhoA信號通路、促進神經生長因子表達有關。此外癌癥、阿米巴病、鉑耐藥3個信號通路也富集了較豐富的基因,這3條通路參與細胞的增殖、分化、運動、遷移,還與炎性反應、血管的生成、細胞凋亡等多種生物功能相關。因此推斷行氣活血通絡方可能通過以上通路發揮治療神經根型頸椎病的作用。

綜上所述,本研究利用網絡藥理學方法對行氣活血通絡方治療神經根型頸椎病的機制進行探討,發現此方包含多種活性成分,涉及多種信號通路和生物過程,體現了“多成分-多靶點-多途徑發揮作用的特點。以期為研究行氣活血通絡方治療作用的分子機制及藥理學機制奠定基礎,同時也為其他復方中藥的研究提供思路和方法。