基于腸道微生態研究山楂粉調節高脂膳食小鼠血脂的機制

寧素云，滕 丹，慕楊娜，王 祎，孫笑宇

（1.山西藥科職業學院，山西太原 030031；2.遼寧何氏醫學院，遼寧沈陽 110163；3.遼寧省中醫研究院，遼寧沈陽 110034）

隨著生活水平的日益提高,高血脂癥已經逐漸成為我國最為常見的慢性病之一。高血脂癥狀誘發的一系列疾病,如糖尿病、高血壓、腦卒中及心梗等的高風險因素［1］。根據《中國成人血脂異常防治指南（2016年修訂版）》 數據顯示,我國血脂異常人數已達到4.3億,而且誘發的冠心病的發病率以每10年30%的速度遞增［2］。由于高血脂癥屬于代謝類慢性疾病,合理的飲食可以有效防治高血脂癥的發生,然而,考慮到人群飲食習慣難于改變,而以藥物對高血脂癥進行糾正常常無法被患者接受,且存在用藥風險［3］,因此探討藥食同源的藥物改善高血脂癥,是一個很好的解決方法［4］。

現有的研究顯示,有大量的中藥/有效成分可對血脂異常進行治療。如藥物有紅曲、澤瀉、大黃、虎杖、何首烏、決明子、絞股藍等,而有效成分則有麥角甾醇、生物黃酮、皂苷、氨基多糖、不飽和脂肪酸等［4］。相比其他中藥飲片,山楂的調脂功能及應用潛力更大。首先,根據以往的研究,山楂本身含有多種活性成分,如黃酮、有機酸、膳食纖維和固醇等［5］。其中,山楂黃酮是最重要的降脂有效成分之一［6］。另一方面,山楂是國家衛生健康委員會公布的第一批藥食同源中藥材之一。因此,山楂除了可配伍藥物直接組方降脂外,亦可安全地應用于食品。然而,現針對山楂降脂研究多集中于對其血脂水平的調節［7］,或者對其單一組分的藥理學研究［8］,而對藥物整體起效機制的研究較少?？紤]到山楂有效成分的復雜性,對單一成分、單一參進行簡單的研究,已經無法系統了解山楂降低血脂的起效機制?；诖?本研究擬通過腸道菌群變化的方式,間接的分析其起效機制［9］。

越來越多的證據表明,腸道微生物對于高膽固醇血癥的形成有重要作用,甚至腸道菌群失衡是動脈粥樣硬化獨立的危險因素之一［10］。而微生物群落構成,也在脂肪的代謝過程中發揮了重要的作用［11］。大量研究顯示,有效成分可通過對腸道菌群的調節,加速膽固醇的代謝,并進一步降低高血脂癥的發生［12-14］。而以腸道微生物為切入點,對成分復雜的食物/藥物進行機制研究,是解決復雜機制研究的一個重要的手段?；谏鲜鲅芯勘尘?本研究基于腸道菌群變化對山楂飼食前后,小鼠腸道微生態的演替情況進行分析,并進一步推測山楂改善高脂模型小鼠的血脂變化的腸道微生物作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 本研究共納入30只28～56日齡的小鼠為研究對象,除6只為C57BL/6 J小鼠（SCXK蘇202015-0001）外,其余24只均為ApoE -/-小鼠 （SCXK蘇202015-0001）,上述小鼠購買自北京隆安實驗動物養殖中心［許可證號SCXK （京）2014-0040］。所有小鼠均按照國家嚙齒類動物飼養標準,飼養于遼寧中醫研究院動物實驗中心。

1.2 材料與儀器 山楂凍干粉（批號SH-01-02,西安首禾生物科技有限公司,每克凍干粉相當于10 g山楂生藥）；E.Z.N.A.? Stool DNA試劑盒 （批號D4015,美國Omega Bio-tek公司）；AxyPrep PCR clean up Kit （批號APPCR-250G,美國Axygen公司）；Quant-iT Pico Green ds-DNA Assay Kit （批號P11496,美國Thermo Fisher Scientific公司）；MiSeq Reagent Kit V3 （600 cycles）（批號MS1023003,美國Illumina公司）；AU5800型全自動生化儀（美國貝克曼庫爾特公司）。

1.3 分組及建模 6只C57BL/6 J小鼠為正常組,常規飲食喂養；常規鼠糧配方為面粉20%、米粉10%、玉米20%、麩皮26%、豆餅20%、魚粉2%以及骨粉2%。其余24只ApoE-/-小鼠均予高脂高膽固醇飲食飼養,該飼料是在常規飼料的基礎上,增加15%動物油和0.25%膽固醇。

經過7 d適應性喂養后,依據小鼠體質量隨機為4組（每組6只）。其中,對照組常規高脂高膽固醇飲食飼養+生理鹽水灌胃。高、中、低3個劑量組常規高脂高膽固醇飲食飼養+山楂凍干粉灌胃,添加劑量分別為1、2、5 g/（kg體質量）的山楂凍干粉水溶液。實驗共進行12周,小鼠在最后一次灌胃山楂凍干粉水溶液后,禁食24 h,腹腔麻醉后處死小鼠,同時取小鼠的血樣及大腸內容物,做下一步分析。

1.4 血清脂質水平 動脈取血后,分別應用全自動生化儀器測定小鼠血清內的TG、TC、LDL-C及HDL-C等參數的水平。

1.5 腸道微生物測序及生物信息學分析 應用糞便DNA試劑盒對研究所收集到的腸道內容物樣本進行提取,電泳檢測樣本提取質量,并以紫外分光光度計對所得的DNA樣本進行定量。設計16SrDNA保守區的通用引物,并添加測序通用接頭和樣本特異性Barcode序列,ACTCCTACGGGAGGCAGCAG （通用引物為338F）,GGACTACHVGGGTWTCTAAT （通用引物為806R）,對rRNA基因可變區（V3+V4）或特定基因片段進行PCR擴增。將PCR擴增的產物通過2%濃度的瓊脂糖-凝膠電泳進行檢測,并對目標片段進行針對性的回收,保證插入的片段范圍為200～450 bp。在Promega Quanti Fluor熒光定量的系統內,應用DNA檢測試劑盒對純化后的PCR產物對比文庫進行定量,確定獲得的PCR濃度為2 nmol/L以上。梯度稀釋合格的上機測序文庫,依據測序量進行混合,NaOH變性后,使所得的PCR變為單鏈,再進一步上機測序。測序以MiSeq進行2×300 bp的兩端測序,應用overlap對獲得的初始數據進行拼接,質控后進行嵌入過濾,最終獲得初始數據（rawdata）并再進一步轉化為對應的可操作分類單元（operational taxonomic units,OTUs）。

應用vegan包對獲得的OTUs在R系統內繪制所獲得菌種豐富度指數（chao1指數）對應的稀疏曲線；主成分分析（principal components analysis,PCA）則以SMICA 14.1軟件進行,首先提取各樣本小鼠糞便樣本內對應的OTUs,應用excel生成為SMICA 14.1所需的格式,載入軟件后進行數據轉化,其中,Model type選擇PCA-x,對所得數據進行autofit后,獲得PCA評分散點圖；為考察各組菌群的具體分布情況,根據各水平下的OTUs,以TBtools軟件的heatmap包制備熱圖,再根據各組內樣品OTUs的平均值,制備柱狀圖,最終確定各樣本內主要菌群在門及屬水平的分布情況；在線進行LEfSe分析（http：//huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy）,分別提取模型-正常、低劑量-模型、中劑量-模型及高劑量-模型等4對數據,分別對其進行線性判別分析效應量（linear discriminant analysis effect size,LEfSe）分析,對比各組的線性判別分析 （linear discriminant analysis,LDA）值變化；分別抽取各組的在門水平及屬水平的LDA值,兩兩對比后,應用TBtools的heatmap包,制備熱圖,最終確定模型組內重要的差異菌群。

1.6 統計學分析 應用SPSS 18.0對所得數據進行統計,計量資料以（）表示,組間對比應用獨立樣本t檢驗進行分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 山楂粉對于小鼠血脂的影響 經過12周的自由進食后,小鼠的血脂具體變化如表1所示。結果提示,與空白組比較,模型組小鼠血液內的TG、TC、LDL-C含有量顯著升高（P＜0.01）,HDL-C含有量顯著下降（P＜0.01）。給藥組,隨著鼠糧內山楂的不斷攝入,小鼠血液內的TG、TC、LDL-C含有量也開始下降,HDL-C含有量升高。其調節血脂異常的效果,同添加的山楂粉劑量相關。相比于其山楂低、中劑量組,高劑量組更能顯著降低小鼠內的TG、TC及LDL-C水平,同時提升HDL-C的水平（P＜0.05,P＜0.01）,然而,仍然同正常組有較大的區別。結果提示,山楂粉可有效地緩解高脂飲食所致的血脂異常且呈劑量依賴性。

表1 山楂凍干粉對小鼠血脂水平的影響（， n=6）

表1 山楂凍干粉對小鼠血脂水平的影響（， n=6）

注：與正常組比較,##P＜0.01；與模型組比較,*P＜0.05,**P＜0.01。

2.2 山楂粉對小鼠腸道菌群多樣性變化的影響 為了獲得山楂粉對小鼠腸道菌群微生態的影響,本研究考察了5組小鼠的腸道菌群查奧1 （Chao1）值的變化情況,Chao1指數可反映樣品內微生物群落的豐度和多樣性情況,即α 多樣性指數信息。其具體變化趨勢如圖1所示。由結果可知,高劑量組的Chao1指數顯著性高于其他4組,而低劑量組的Chao1指數則低于其他各組。上述結果提示,隨著山楂粉劑量增加,可大幅提升小鼠體內的菌群豐富程度。同時,根據所得結果可以看出,在整個飼養過程中,正常組及模型組內豐度的變化,基本無太大的波動?？梢酝茰y,兩組間雖然菌群的構成出現差異,但是豐度的變化情況類似,為進一步類比上述5組小鼠腸道菌群的變化情況,本研究對獲得的OTUs信息進行了主成分分析。

圖1 不同劑量山楂凍干粉對小鼠腸道菌群稀釋曲線的影響

2.3 山楂粉對大鼠腸道菌群主成分差異性分析 PCA分析（主成分差異性分析）可有效地對獲得的復雜數據進行降為處理,同時對比統計不同組別內數據的構成相似度。本研究應用PCA分析,考察了山楂粉對小鼠腸道菌群構成的影響。由圖2可知,高脂飲食可直接影響小鼠的腸道菌群構成,雖然模型組及正常組的Chao1指數變化接近,但兩組的腸道菌群構成有很大區別。隨著山楂粉的添加,小鼠的腸道菌群構成也開始和正常組類似。但是,不同劑量山楂粉亦會直接影響小鼠的菌群構成。如低劑量組和高劑量組的菌群構成較為集中,而中劑量組的變化則較大。由PCA的結果可知,山楂粉的添加可以有效的改善高脂膳食小鼠的菌群構成情況。然而,其同正常組相比仍有很大的差異性,特別是中劑量組,雖然其菌群構成同模型組有很大區別,但是同正常組比較,仍然區別較大?；诖?本研究進一步分析不同水平下菌群變化的情況,以確定不同組內小鼠的腸道菌群變化情況。

圖2 不同劑量山楂凍干粉對小鼠腸道菌群構成的影響

2.4 山楂粉對小鼠腸道菌群構成的影響 圖3展示了不同組內小鼠在門水平上的構成情況。由結果可知,相比于模型組,其他各組內擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）的水平顯著性上升。而厚壁菌門（Firmicutes）的變化趨勢并不明顯。而上述4門為各組內的優勢菌群。而相比于其他各組,模型組小鼠內的無法分類的細菌（Bacteria_ unclassified）豐度更高。

圖3 小鼠腸道內容物腸道菌群在門水平上的相對豐度

圖4 小鼠腸道內容物腸道菌群在屬水平上的相對豐度

圖4展示了不同組內小鼠在菌屬水平上的構成情況。由結果可知,和門水平相比,各個組內菌屬的分布更加分散,而最主要的變化是芽孢桿菌（Bacllaceae_ 2_ unclassified）屬、Parasutterella屬、擬桿菌屬（Bacteroides）屬和Coprpcpccus屬。相比于模型組,其他4組的Bacllaceae_ 2_unclassified的豐度大幅下降,而 Parasutterella屬、Bacteroides屬和Coprpcpccus屬的豐度則大幅上升,結果提示,上述菌屬是直接影響高脂模型小鼠菌群差異的關鍵菌屬?？紤]到不同飼喂方式,對小鼠腸道微生態的影響較大,為了進一步全面對比各組內菌群豐度的變化情況,本研究進一步對菌群進行了β 分析,已獲得山楂粉緩解小鼠高脂模型的關鍵菌門/屬。

2.5 山楂粉調節小鼠腸道菌群構成的主要差異菌群 為了獲得山楂粉調節小鼠腸道菌群微生態的主要差異菌群,本研究應用LEfSe分析對獲得的數據進行了β 差異性分析。對獲得的OTUs的LDA進行統計后,獲得的結果如圖5所示。由圖5D可知,正常組及模型組的菌群構成差異性較大,在各個水平上（門綱目科屬種）,共有62個OTUs出現了差異性。另,隨著山楂粉的增加,各組同模型組的差異性也隨之增加,如低劑量組-模型組（圖5A）、中劑量組-模型組（圖5B）及高劑量組-模型組（圖5C）的OTUs差異值分別為35、48、68。該結果提示,隨著山楂粉劑量的不斷增加,模型組內小鼠腸道菌群的構成也隨之大幅改變。為了進一步的對比各組變化的菌群及趨勢,本研究分別以各組同模型組OTUs的LDA值制作熱圖,見圖6。

由圖6A可知,在門水平上,正常組-模型組及山楂高劑量組-模型組的差異性相似程度最高,除了Bacteroidetes外,其他各主要構成菌門的構成基本一致。與之相對,除Deferribacteres （脫鐵桿菌門）外,山楂低劑量組-模型組各主要構成菌門的構成基本無差異性。該結果提示,隨著山楂粉的不斷增加,模型小鼠的腸道菌群構成會隨時發生變化,并趨近于正常組小鼠的情況。雖然可以顯著改善模型小鼠的血象（P＜0.05,P＜0.01）,但是其仍然高于正常組（P＜0.05,P＜0.01）。

由圖6B可知,在屬水平上,其結果同門水平的結果類似。正常組-模型組及山楂高劑量組-模型組的差異性相似程度最高,而山楂低劑量組-模型組各主要構成菌門的構成基本無差異。經過對屬水平分析后可以看出,腸桿菌（Enterobacier）、支原體（Mycoplasma）在低劑量組及模型組的構成無差異,而在其他3組內均顯著上升（| LDA | ＞2.0）。而毛螺旋菌屬 （Parasutterella ）、埃希氏桿菌屬（Escherichia）、毛螺菌屬 （Lachnospiraceae_ unclassified）及艾克曼菌屬（Akkermansia_ unclassified）則僅僅在正常組及高劑量組中濃度顯著性上升（| LDA | ＞2.0）可以將上述菌群,視為山楂粉改善腸道菌群構成的生物標志物。

3 討論

作為藥食同源的藥物,山楂具有調節高血脂癥的功能［7］。然而,此類報道多以復方或有效成分角度出發［15-16］,針對山楂飲片降血脂的研究并不多見。另一方面,在高瑩等［17］的研究中,山楂和山楂黃酮雖然可以顯著降低大鼠血清的TG水平,但是對大鼠血清TC沒有明顯的改善作用,其推論山楂改善血脂的功能同飼料的配方關系密切。在本實驗中,雖然山楂粉可以改善小鼠的TG、TC、LDL-C及HDL-C等血脂指標。然而,即使攝入了山楂粉,小鼠的血脂濃度仍同正常組有很大的區別（P＜0.05）。另一方面,趙尹銘等［18］報道山楂的降血脂有效成分有黃酮、熊果酸及山楂膳食纖維等。上述研究提示,山楂改善高血脂癥的機制極為復雜,而單純以山楂粉治療小鼠的高血脂癥,將是一個長期逐漸改善的過程。因此,對其機制的分析,相比于單純的血脂參數研究,以腸道菌群構成變化的角度為切入點,是一個良好的解決方案。

高脂飲食（high fat diet,HFD）誘發高血脂癥可致腸道微生態的變化被廣泛報道［19-20］。毫無疑問,HFD可致血脂積累,并進一步誘發高血脂癥,而在此過程中,腸道微生態起到了決定性的作用［21］。在高脂飲食的攝入過程中,小鼠腸道內產生的乙酸菌會過度繁殖,并進一步提升小鼠腸道代謝物內乙酸的濃度,而隨著乙酸濃度的上升,其可刺激β 細胞分泌了更多的胰島素,并上調小鼠體內胃泌素和胃饑餓素分泌［22］,通過對腸-腦軸線（gut-brain axis）的調整,增加小鼠對食物的攝入。而HFD可調整腸道代謝物的組成,最終引起腸道微生態的改變［23］?？紤]到腸道微生態同脂肪代謝的相關性,可以推測,山楂在改善血脂癥的過程中,亦會直接影響模型小鼠的腸道微生態變化。

本實驗中,相比于其他4組,高劑量組獲得了最高的Chao1指數。該結果表明,大量攝入山楂粉,可以通過提升HFD小鼠腸道菌群的豐富程度,快速調整HFD小鼠的腸道微生物構成。另一方面,根據Chao1指數可以看出,其他4組小鼠的腸道微生物豐富程度接近,結果提示,在中低劑量下,山楂對HFD小鼠腸道微生物的調整較為溫和。為了進一步確定各組小鼠腸道微生物的差異性,本研究對樣本進行了PCA分析,相比于模型組,低劑量組及高劑量組都和正常組更為接近。雖然中劑量組的離散情況較為嚴重,但是參考低劑量組及高劑量組的結果,可以推測其是在不斷調整菌群構成的過程中。由此可知,在山楂緩解HFD小鼠高血脂癥的過程中,小鼠的腸道微生態也隨之改變,且HFD小鼠腸道菌群的構成情況趨于正常。

根據對小鼠腸道微生物構成的α 分析結果可知,相比于模型組,山楂粉組及正常組內擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門 （Proteobacteria）、疣微菌門 （Verrucomicrobia）的水平顯著性上升。而厚壁菌門（Firmicutes）的變化趨勢并不明顯。根據文獻報道,擬桿菌門（Bacteroidetes）同小鼠肥胖發生的關系密切,小鼠長期攝入HFD,腸道內的擬桿菌門豐度會隨之下降［24］。除擬桿菌門外,厚壁菌門的豐度也同HFD相關。根據Vaughn等［25］的研究,隨著HFD的攝入,小鼠腸道內的厚壁菌門/擬桿菌門（Firmicutes/Bacteriodetes,F/B）比值會隨之增加。根據本研究的結果,隨著山楂粉的攝入,HFD小鼠的腸道微生物F/B值會隨之下降,提示山楂粉有調節F/B值的效果。屬水平上,相比于模型組,其他4組的bacllaceae_ 2_ unclassified的豐度大幅下降,而Parasutterella屬、Bacteroides屬和Coprpcpccus屬的豐度則大幅上升。其中,Parasutterella同血脂膽固醇代謝的關系密切。在Yin等［26］的研究中,小鼠對于HFD的響應程度很高,而當以褪黑素調節HFD小鼠脂代謝紊亂時,擬桿菌、Alistipes和Parasutterella的相對豐度會隨之增加。根據Nadal研究可知［27］,bacteroides屬同肥胖患者體質量下降反向相關,可以推測,bacteroides屬可加速脂肪的代謝。

圖5 小鼠腸道內容物腸道菌群的LEfSe分析

圖6 小鼠腸道內容物腸道菌群的在門及屬水平上的差異值LDA值分布

本研究進一步應用β 分析對獲得的結果進行確認。根據LEfSe檢驗結果可知,隨山楂粉飼食劑量的上升,各組小鼠腸道菌群差異性與模型組相比,顯著性提升。結果提示,隨著山楂粉劑量的增加,小鼠腸道微生態調整的也隨之加速。另一方面,本研究又通過LDA值進一步篩選出了山楂改善小鼠高血脂癥的關鍵微生物,分別為Parasutterella、Escherichia、Lachnospiraceae_ unclassified及Akkermansia_ unclassified。劉思穎等研究［28］在HFD所致脂代謝障礙的小鼠腸道內,糞球菌屬Akkermansia及Lachnospiraceae較正常組減少,隨著黃芩苷的干預,上述2個菌屬會顯著上升；和其研究類似,由于上述兩者僅僅在正常組及山楂高劑量組中劑量顯著性上升| LDA| ＞2.0）,結果提示,在山楂調節脂代謝的過程中,需要在較高劑量下,長時期的飼食,方可實現對血脂的控制?？梢源_定,上述菌屬是改善小鼠高血脂癥的過程中的關鍵菌屬。

綜上所述,山楂粉可以有效緩解HFD所致的脂代謝紊亂的癥狀,加速腸道菌群的恢復,并通過對特定菌群的調整,實現其調節血脂代謝的目的。然而,本研究僅僅針對菌群的群落變化進行了研究,若要進一步的完善其機制,則需要通過對糞便的代謝組學進行交叉對比后,方可實現。