B/C基因型的乙型肝炎病毒對不同免疫階段慢性乙型肝炎患者T淋巴細胞及其亞群的影響

高 鵬，雒艷萍，李俊峰

(1.蘭州大學第一醫院傳染病研究室，蘭州 730000； 2.蘭州大學基礎醫學院免疫教研室，蘭州 730000)

乙型肝炎的發生發展與機體病理性免疫損傷、特別是與以T淋巴細胞及其亞群介導的細胞免疫應答密切相關。乙型肝炎病毒在我國以B基因型和C基因型為主，B/C基因型的乙型肝炎病毒的發病機制有很大差別，但是目前很少有文獻探討在不同免疫階段B/C基因型乙型肝炎病毒感染的人體中T淋巴細胞及其亞群表達譜的差異，本文就此進行探討。

1 資料與方法

1.1 研究對象

分層隨機選取2016年1月至2017年12月在蘭州大學第一醫院門診和住院的確診為慢性乙型肝炎的患者375例，男260例，女115例，年齡18～60歲,所選患者病例完整。經臨床和實驗數據分析后，確定慢性乙型肝炎攜帶者并且丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminetransferase ALT)正常的124例 (ALT<40 U/L)， 其中B基因型61例，C基因型63例；ALT≥正常上限，且<2倍增高的慢性乙型肝炎患者127例 (40 U/L≤ALT<80 U/L)， 其中B基因型65例，C基因型62例；ALT大于等于正常上限2倍增高的慢性乙型肝炎患者124例 (ALT≥80 U/L)，其中B基因型63例，C基因型61例,各組B/C基因型的病毒載量差異無統計學意義。分別觀察在不同組別中B/C基因型的乙型肝炎病毒對T淋巴細胞總數、輔助/抑制性T淋巴細胞(T helper /inhibition lymphocyte，Th/i)、抑制/細胞毒性T淋巴細胞 (T inhibition/cytotoxic lymphocyte, Ti/c)、輔助性/細胞毒性T淋巴細胞(T helper / cytotoxic lymphocyte, Th/c)，以及血清中白細胞介素(interleukin，IL)-2、干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)、IL-4 和IL-10的影響。慢性乙型肝炎的診斷標準符合2010年慢性乙型肝炎防治指南《病毒性肝炎防治方案》[1]。同時排除妊娠期婦女、中度和重度脂肪肝患者、酒精肝患者、藥物性肝損傷患者、自身免疫性肝損傷患者、曾經接受過抗病毒治療的患者，以及合并其他肝炎感染的患者和并發其他心血管、腎臟等重大臟器病變患者。研究對象包括患者和健康人均簽署知情同意書，本試驗獲得蘭州大學第一醫院倫理委員會批準。

1.2 儀器和試劑

熒光定量PCR分析儀購自德國 Lightcycler ROCH公司；流式細胞儀(FACS Calibur)及配套試劑購自美國BD公司；AU400型全自動生化分析儀購自日本OLYMPUS公司；XE2100型全自動血細胞計數儀購自日本SYSMEX公司。

乙型肝炎抗原和抗體定量檢測試劑盒購自北京萬泰生物藥業股份有限公司，乙型肝炎病毒DNA檢測試劑盒、乙型肝炎病毒基因分型檢測試劑盒均購自深圳匹基生物工程有限公司，IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10細胞因子檢測盒均購自晶美生物技術有限公司。

1.3 方法

乙型肝炎抗原和抗體定量檢測：采集患者靜脈血并分離血清，按化學發光免疫分析儀的操作步驟進行樣本檢測。

乙型肝炎病毒DNA檢測：采集患者靜脈血并分離血清，按乙型肝炎病毒 DNA 定量檢測試劑盒和基因擴增儀的操作步驟進行檢測，敏感度>500 copies/mL。

乙型肝炎病毒基因分型：采集患者靜脈血并分離血清，按乙型肝炎病毒基因分型檢測試劑盒和基因擴增儀的操作步驟進行實時熒光定量聚合酶鏈式反應檢測。

外周血細胞分類計數：無菌操作采集靜脈血 2～3 mL，乙二胺四乙酸二鉀抗凝，用XE2100型全自動五分類血細胞分析儀進行淋巴細胞計數檢測。

CD3、CD4、CD8 單抗標記的制備：取100 μL 乙二胺四乙酸二鉀抗凝血加 20 μL 三色單克隆抗體(抗CD3 PE-CY5/抗CD4-FITC/抗CD8-PE)，陰性對照取 100 μL EDTA-K2 抗凝血加20 μL鼠抗人 IgG-PE-CY5/IgG-FITC/IgG-PE，混勻，室溫放置20 min。加入Muti-Q-Prep 溶血儀處理，每份標本均設定測定管和陰性對照管。

淋巴細胞分類檢測：用流式細胞儀 (FACS Calibur)檢測淋巴細胞表面表達的 CD3、CD4及 CD8，結果以百分率(%)表示。

細胞因子檢測：采集患者靜脈血并分離血清，按IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10檢測試劑盒的操作步驟進行酶聯免疫吸附試驗。

1.4 統計學分析

采用SPSS 17.0軟件，計量資料以均數±標準差來表示，采用獨立樣本的t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

不同免疫階段的B/C基因型乙型肝炎病毒對慢性乙型肝炎患者T淋巴細胞及其亞群的影響是不相同的，由結果可見,在ALT正常組中，B/C基因型乙型肝炎病毒對T淋巴細胞及其亞群無明顯區別，而在ALT異常組中，B/C基因型的乙型肝炎病毒對T淋巴細胞及其亞群的影響有明顯區別，且以ALT≥正常上限2倍組中為甚，具體表現為在ALT≥正常上限、且小于2倍增高的慢性乙型肝炎患者組中，反映Th1型淋巴細胞的細胞因子IL-2、IFN-γ,C基因型組中較B基因型組中有所升高，差異有統計學意義，而其他指標差異無明顯統計學意義，而在ALT≥正常上限2倍增高的慢性乙型肝炎患者組中，B/C基因型乙型肝炎病毒對T淋巴細胞及其亞群有明顯影響。T淋巴細胞總數、Th/i淋巴細胞在C基因型中較B基因型少，Ti/c淋巴細胞在C基因型中較B基因型多，Th/c比值在C基因型中較B基因型下降明顯，C基因型甚至出現倒置。在Th細胞亞群方面，反映Th1型細胞的細胞因子IL-2、IFN-γ，C基因型中較B基因型中明顯升高，而反映Th2細胞的細胞因子IL-4、IL-10，C基因型中較B基因型中明顯下降(表1～3)。

3 討論

乙型肝炎病毒已發現有A～I 9個基因型，在我國以C基因型和B基因型為主。乙型肝炎病毒基因型和疾病進展及干擾素治療效果有關，與C基因型感染者相比，B基因型感染者較早出現乙型肝炎e抗原血清學轉換，較少進展為肝硬化和原發性肝細胞癌，并且乙型肝炎e抗原陽性患者對干擾素治療的應答率高于C基因型[2-3]，但是其原因鮮見探討。同時慢性乙型肝炎患者可處于不同的病變階段，具體分為免疫耐受期、免疫清除期、非活動或低 (非) 復制期以及再活動期，在不同階段，免疫反應是不同的[4-5]，可表現為免疫耐受和免疫應答。當機體處于免疫耐受狀態，機體不發生免疫應答，多成為無癥狀攜帶者，ALT水平正常，肝組織學無明顯異常并可維持數年甚至數十年。但當機體處于免疫應答狀態時，常伴有ALT持續或間歇升高，肝組織學中度或嚴重炎癥壞死，肝纖維化可快速進展，部分患者可發展為肝硬化和肝衰竭[4,6]。同時臨床上又經常以ALT≥2倍正常上限作為抗病毒治療的一個常用標準，因此本研究以此為節點，分析不同ALT狀態下病毒載量與機體免疫反應的關系。乙型肝炎病毒感染人體后，機體主要依靠細胞毒效應與非細胞毒效應兩種免疫機制清除病毒，其中T淋巴細胞參與的細胞毒效應起主導作用[7-8]，T淋巴細胞依據表面分化抗原分為CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞，T淋巴細胞中的 CD4+細胞通過分泌細胞因子，促進特異性B細胞和細胞毒性T淋巴細胞成熟和增殖，具有較強的抗病毒效應，CD8+細胞通過細胞溶解或非溶解機制來清除病毒。Th細胞又依據分泌細胞因子的不同分為Th1亞群和Th2亞群，同時有文獻顯示在乙型肝炎病毒感染機體后出現Th細胞亞群的異常[9-10]，但是目前鮮見有文獻探討在不同免疫階段不同基因型的乙型肝炎對T淋巴細胞及其亞群的影響。本研究主要通過比較分析不同基因型的乙型肝炎病毒在不同免疫階段其T淋巴細胞和亞群的差別，來探討B/C基因型的乙型肝炎病毒對患者臨床表現及治療預后差別的重要原因。

表2 ALT≥正常上限、且<2倍增高的慢性乙型肝炎患者組中B/C基因型的免疫功能狀態(n=127)Table 2 Immune function in ALT greater than or equal to the upper limit of normal, and less than 2 times higher than the upper limit of normal type B and type C genotypes chronic hepatitis B patients (n= 127)

表3 ALT≥正常上限2倍增高的慢性乙型肝炎患者組中B/C基因型的免疫功能狀態(n=124)Table 3 Immune function in ALT greater than or equal to 2 times higher than the upper limit of normal type B and type C genotypes chronic hepatitis B patients (n= 124)

本研究結果顯示在不同免疫階段B/C基因型乙型肝炎病毒對慢性乙型肝炎患者T淋巴細胞及其亞群的影響是不相同的。在ALT正常組中，B/C基因型乙型肝炎病毒對T淋巴細胞及其亞群無明顯區別，這可能是因為在此階段機體大致處于免疫耐受階段，病理性的免疫反應尚不強烈，即使乙型肝炎病毒基因型不同，它們引起的病理性免疫反應尚無明顯差別[9]，而在ALT異常組中，B/C基因型的乙型肝炎病毒對T淋巴細胞及其亞群的影響有明顯區別，且以ALT≥正常上限2倍組中為甚。據現有文獻推測認為，機體感染乙型肝炎病毒后，會引起機體免疫功能的紊亂，結合本研究結果認為機體感染乙型肝炎病毒后，特別是在免疫應答階段，T淋巴細胞下降，并且以C基因型為甚，這說明C基因型乙型肝炎病毒感染人體后對機體有一定的免疫抑制作用，特別是對 CD4+T淋巴細胞有一定抑制作用，這點也說明C基因型乙型肝炎病毒感染人體后病毒很難被清除，因而引起的病理損傷較B基因型強烈[11]。在免疫應答階段，B/C基因型的乙型肝炎病毒對 CD4+T淋巴細胞亞群的研究結果提示乙型肝炎病毒感染機體后引起 Th1、Th2細胞之間的不平衡，Th1、Th2應答之間的平衡是維持正常免疫反應的重要環節, 在清除病毒和腫瘤、誘導免疫耐受等方面起著關鍵性作用[10]。本研究中反映Th1細胞的細胞因子IL-2、IFN-γ在C基因型中較B基因型中明顯升高，Th1細胞的誘導分化與病毒清除有關，并同時與肝組織的病理損傷相關，據此推測Th1細胞的增高導致C基因型乙型肝炎病毒感染人體后較B基因型病情發展迅速，且難以治療，而反映Th2細胞的細胞因子IL-4、IL-10，在C基因型中較B基因型明顯下降。Th2細胞的誘導分化能抑制 Th1細胞的分化，導致乙型肝炎病毒感染的慢性化，又有利于防止 Th1細胞應答過度而造成的病理損傷，這也反映了C基因型乙型肝炎病毒感染人體后，病情更容易慢性化且難以治愈，并且病情的發展較B基因型迅速、難治[12]。

綜上所述，B/C基因型的乙型肝炎病毒在不同免疫階段對機體T淋巴細胞及其亞群的影響是不同的，對其差異性的對比分析可以進一步幫助了解B/C基因型的乙型肝炎病毒在病情進展、預后、治療等方面的差異。