響應面優化水酶法制備“紙皮”扁桃油

田榮榮 牛 童 胡 靜 肖勛澤 許新橋 王 偉

(林木遺傳育種國家重點實驗室；中國林業科學研究院林業研究所1，北京 100091) (北京城市學院生物醫藥學部2，北京 100094)

扁桃(Prunusdulcis(Mill.) D.A.Webb.)屬薔薇科桃屬扁桃亞屬植物[1-3]。扁桃是著名的干果和木本油料植物，與核桃、榛子、腰果并稱為四大干果，在世界范圍內扁桃的貿易量大、交易額高[4]。我國種植扁桃有1 300年以上的歷史[3]。目前，扁桃主要集中在新疆喀什等地區，主栽品種為“紙皮”扁桃(Prunusdulcisvar. Zhipi)。該品種仁油脂質量分數54.7%～57.7%[3]，其中不飽和脂肪酸質量分數高達92.3%[5]，以油酸、亞油酸為主，可作為高檔食用油，具有開發為基礎油、按摩油、發用油、防銹油以及高檔化妝品的潛力[3]。

水酶法是以水為介質，在機械破碎的基礎上利用酶對植物組織的降解作用釋放油脂的工藝。在我國，以水為介質制備芝麻油的歷史長達1 600多年。水酶法中纖維素酶、果膠酶等能破壞細胞壁，而蛋白酶則滲透到脂質體膜內，對脂多糖、脂蛋白進行降解，這有利于油脂從脂質體中釋放，進一步提高以水為介質提取油脂的效率[6-9]。水酶法的條件溫和，酶解溫度低，無需借助有機溶劑以及強酸、強堿的條件，得到的油脂成色好，副產物蛋白質等變性程度小[10]。

響應面優化即響應曲面設計方法(Response Surface Methodology，RSM)，其通過實驗設計結合實驗數據驗證，采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應值之間的函數關系，通過對回歸方程的分析獲得最優工藝參數的一種高效方法。響應面優化被廣泛應用到水酶法提取油脂工藝優化中，王新明等[9]利用響應面優化了紅樹莓籽油工藝油的制備工藝，高定烽等[11]利用響應面優化了芥末籽油的制備工藝。

本研究以“紙皮”扁桃為原料，采用水酶法制備“紙皮”扁桃油，在料液比、酶添加量、pH值、酶解時間、酶解溫度等單因素實驗的基礎上，響應面設計獲得最佳工藝參數，以期為“紙皮”扁桃等油脂資源利用和開發提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 原料與試劑

“紙皮”扁桃種仁，產自新疆喀什(陰干，含水量4.88%)，取仁、去皮、磨碎、過40目篩后-18 ℃儲存備用。

氫氧化鈉、鹽酸、石油醚：分析純；果膠酶Pectinex Ultra SP-L、纖維素酶Celluclast 1.5L、水解蛋白酶Alcalase 2.4L、風味蛋白酶Flavourzyme 500MG、中性蛋白酶Neutrase 1.5MG、復合蛋白酶Protamex。

1.1.2 儀器與設備

FSJ-A05B1型多功能粉碎機，HWS-12型電熱恒溫水浴鍋，Kaida TGL16M型離心機，SCILOGEX MX-S渦旋振蕩器，Five Easy Plus臺式pH計。

1.2 方法

1.2.1 水酶法制備油脂工藝流程

稱取定量樣品，按料液比加入水，渦旋振蕩2 min，調pH后，按實驗需要加入適宜酶活單位的酶，渦旋振蕩2 min，經恒溫水浴提取后，利用冷凍解凍破乳(-20 ℃冷凍15 h以上，水浴鍋40 ℃水浴解凍)后，5 000 r/min 離心20 min，收集上層油相(清油)，并稱重，棄去乳相及水相，計算出油率。

出油率=(上層清油質量/脂肪含量)×100%

1.2.2 總含油率的測定

準確稱取定量樣品，用濾紙包好后，置于索氏提取器中，加入4倍量的石油醚，加熱提取4 h；每份樣品重復提取3次，50 ℃下減壓蒸餾回收石油醚，真空干燥箱中干燥至恒重，得“紙皮”扁桃油，計算總含油率(油脂含量)。

總含油率=油脂總量/樣品質量×100%

1.2.3 酶的篩選

稱取5 g過40目篩“紙皮”扁桃仁粉末，料液比1∶5，酶解5 h，各種蛋白酶統一添加酶活6 000U/5 g，果膠酶和纖維素酶添加量為1%。各種酶最適酶解條件：中性蛋白酶pH 7.0，溫度50 ℃；復合蛋白酶pH 7.0，溫度50 ℃；水解蛋白酶pH 8.5，溫度40 ℃；風味蛋白酶pH 6.0，溫度40 ℃；果膠酶pH 5.5，溫度55 ℃；纖維素酶pH5.5，溫度55 ℃。

1.2.4 酶的配比

在pH值5.5、溫度55 ℃、料液比1∶5、酶解5 h，固定果膠酶活性為800 U/5 g 調整水解蛋白酶添加活性，水解蛋白酶添加活性為4 000、5 000、6 000、7 000、8 000 U/5 g。

在pH值5.5、溫度55 ℃、料液比1∶5、酶解5 h，固定水解蛋白酶活性為6 000 U/5 g調整果膠酶添加活性，果膠酶添加活性為200、400、800、1 200、1 600 U/5 g。

1.2.5 酶的添加順序

在pH 5.5、溫度55 ℃、料液比1∶5、酶解5 h，酶添加比例果膠酶∶水解蛋白酶=1∶5，對果膠酶和水解蛋白酶同一時間加入與先加入果膠酶酶解3 h后再加入水解蛋白酶酶解2 h進行比較。

2 結果與討論

2.1 酶的篩選

如圖1所示，各種酶與對照(出油率1.67%)相比出油率有不同程度的提高，其中，復合蛋白酶出油率最高達12.44%，其次是水解蛋白酶(11.99%)和果膠酶(11.60%)，纖維素酶出油率(2.22%)最低。復合蛋白酶出油率提升最高，說明酶的復合使用更有利于油脂的提取。胡濱等[6]利用復合酶制劑對絲瓜籽提取油脂同樣獲得了較好的效果。蛋白酶中水解蛋白酶出油率最高，達11.99%。水解蛋白酶主要作用于絲氨酸內部肽鍵，這說明“紙皮”扁桃油體細胞中的油脂可能被含有絲氨酸較多的蛋白質膜結構束縛。果膠酶主要作用于果膠和其他半乳糖醛酸結構中的α-1,4半乳糖苷鍵，與對照相比果膠酶顯著提升了出油率，出油率達11.60%，這可能是果膠位于釋放油脂分子的關鍵位置上。這與孫月娥等[10]利用果膠酶提取巴旦木油和水解蛋白效果最顯著的結果一致。纖維素酶效果差于果膠酶，纖維素酶主要作用于纖維素中的β-1,4糖苷鍵，與對照相比加入纖維素酶對出油率提升有限，可能是因為纖維素中β-1,4糖苷鍵的水解對“紙皮”扁桃油脂的釋放影響較小，而對絲瓜籽等油脂的釋放可能起到至關重要的作用[6]。本實驗使用的商品化復合蛋白酶，配方未知不利于后期提取工藝的優化。綜上所述，本研究選用果膠酶與水解蛋白酶進行復配提取“紙皮”扁桃油。

圖1 酶的種類對出油率的影響

2.2 酶的添加順序

由圖2可見，果膠酶和水解蛋白酶同時加入，出油率略低于分步加入。推測是因為果膠酶的化學本質為蛋白質，水解蛋白酶酶解果膠酶從而影響果膠酶的活性，一定程度上降低兩種酶復配的效果。分步加入酶對出油率提高效果有限，對比出油率差異不顯著。調整酶添加順序不能有效地提高出油率，為減少操作步驟，控制生產過程中的成本，本研究仍采用同時加入兩種酶開展后續工藝優化。使用復配酶提取油脂，大部分是采用同時加入，張會彥等[7]采用同步加入中性蛋白酶與戊聚糖酶用于胡麻籽油的提取。

注：“果”為果膠酶，“水”為水解蛋白酶。圖2 酶添加順序對出油率的影響

2.3 酶的添加量

由圖3可知，果膠酶固定添加800 U/5 g，水解蛋白酶用量6 000 U/5 g時，出油率最高，達到31.08%。水解蛋白酶固定添加6 000 U/5 g，果膠酶用量為1 200 U/5 g時，出油率最高，達到37.75%。故選擇水解蛋白酶添加活性為6 000 U/5 g和果膠酶添加活性為1 200 U/5 g(酶活性比例果膠酶∶水解蛋白酶=1∶5)復配，開展后續實驗。李曉等[12]在紅花籽油水酶法提取中添加酶活比例木聚糖酶:果膠酶堿性蛋白酶=1∶2∶3時提取率高達73%，這說明不同原料提取油脂對果膠酶的需求不同。

注：1～5分別表示800 U∶4 000 U，1 000 U∶5 000 U，1 200 U∶6 000 U，1 400 U∶7 000 U，1 600 U∶8 000 U(果膠酶∶水解蛋白酶)。圖3 酶添加量對出油率的影響

2.4 酶的配比

pH 5.5、溫度55 ℃、料液比1∶5，固定酶添加比例果膠酶∶水解蛋白酶=1∶5，添加量分別為800 U∶4 000 U，1 000 U∶5 000 U，1 200 U∶6 000 U，1 400 U∶7 000 U，1 600 U∶8 000U(果膠酶∶水解蛋白酶)，酶解5 h。結果見圖3。

“紙皮”扁桃的出油率，在一定范圍內隨著酶的添加量的增加而提高，果膠酶∶水解蛋白酶=1 400 U∶7 000 U時出油率達到最高。再增加酶的添加量，出油率反而下降，可能是因為酶作為蛋白質，過量后有表面活性劑的作用，促進了油脂乳化，不利于其析出。

2.5 料液比對出油率的影響

在pH 5.5、溫度55 ℃，酶添加量為果膠酶∶水解蛋白酶=1 200 U∶ 6 000 U，酶解5 h，研究料液比對出油率的影響。改變料液比分別為1∶4、1∶5、1∶7、1∶9、1∶11、1∶13，結果如圖4所示。

圖4 不同處理對出油率的影響

隨著料液比中液體比例的增加，“紙皮”扁桃的出油率呈現先增加后下降的趨勢，在1∶7之后變化不明顯。液體占比小，物料黏稠度較大，不利于酶接觸催化物料；液體占比過大，反應體系中酶與物料濃度均降低，減少了酶和物料中的底物分子發生接觸的概率。因此液體占比過小或者過大均不利于油脂的提取。針對“紙皮”扁桃當料液比為1∶5時，出油率達到最高，故選擇料液比為1∶5。

2.6 pH對出油率的影響

在55 ℃，料液比為1∶5，酶添加量為果膠酶∶水解蛋白酶=1 200 U∶6 000 U，酶解5 h，調節pH分別為2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5，檢測pH對出油率的影響。由圖4可知，隨著pH值的增加，出油率先增加后降低，在pH3.5出油率最高，達到48.22%。推測可能是提取液偏酸更有利于果膠酶發揮酶活力，而pH變化對水解蛋白酶影響不大，故選擇pH為3.5。

2.7 酶解溫度對出油率的影響

在pH 5.5，料液比為1∶5，酶添加量為果膠酶∶水解蛋白酶=1 200 U∶ 6 000 U，酶解5 h，研究溫度對出油率的影響。分別將溫度設置為35、45、55、65、75 ℃。由圖4可知，55 ℃時，出油率最高，達到37.73%，溫度繼續升高，出油率下降，這可能與酶的最適溫度有關，果膠酶的適用溫度范圍為40～60 ℃，水解蛋白酶的適用溫度范圍為55～70 ℃。故選擇酶解溫度為55 ℃。

2.8 酶解時間對出油率的影響

在pH值5.5、溫度55 ℃、料液比為1∶5，酶添加量為果膠酶∶水解蛋白酶=1 200 U∶6 000 U，研究酶解時間對出油率的影響，設置酶解時間分別為1、2、3、4、5、6 h。由圖4可知，隨著反應時間的延長，出油率增加，酶解3 h后，增加酶解反應時間，并不能顯著增加出油率。推測酶解3 h基本已催化完全物料中的底物。而且“紙皮”扁桃油含有豐富的不飽和脂肪酸，反應時間延長會增加油脂的氧化的風險，增加能耗，故選擇酶解時間為3 h。

2.9 響應面法優化結果與分析

2.9.1 響應面實驗設計與結果

在單因素實驗的基礎上，綜合顯著性差異分析，根據Box-Behnken響應面設計原理，運用Design-Expert 11軟件(Stat-Ease Inc., Minneapolis, MN, USA)，選擇酶解pH(A)、料液比(B)、酶解溫度(C)、酶添加量(D)四個因素為自變量，每個因素設計-1、0、1三個水平，具體因素水平見表1，每組實驗重復3次以估計誤差，以出油率(Y)為響應值，設計四因素三水平的響應面分析實驗優化“紙皮”扁桃油水酶法提取工藝。響應面實驗設計及結果見表2。

表1 “紙皮”扁桃油水酶法提取工藝響應面實驗因素及水平

表2 “紙皮”扁桃油水酶法提取工藝響應面試驗設計及結果

運用Design-Expert 11得到出油率(Y)對自變量酶解pH(A)、料液比(B)、酶解溫度(C)、酶添加量(D)的二次多項回歸模型：

Y=54.80+14.39A+1.79B-7.99C+2.98D-0.332 5AB-7.70AC+1.77AD+5.76BC+0.272 5BD+2.43AD-28.00A2-10.68B2-7.90C2-9.12D2

2.9.2 模型的建立及顯著性分析

由表3還可看出，酶解pH(A)和酶解溫度(C)對響應值出油率(Y)的影響極顯著，交互項AC影響顯著，說明酶解pH值和酶解溫度交互作用顯著。

表3 “紙皮”扁桃油水酶法提取工藝響應面回歸方程模型方差分析

2.9.3 交互作用分析

響應面圖能直接反映各因素與響應值的關系及各個因素間的交互作用，響應曲面坡度越陡、等高線密集成橢圓形表示兩因素交互作用的影響越大，由圖6可以看出，酶解pH和酶解溫度交互作用對“紙皮”扁桃油水酶法提取出油率影響顯著，隨著酶解pH值的增大和酶解溫度的上升，出油率先上升后下降。

圖6 酶解pH與酶解溫度對油提取率影響的響應面

2.9.4 紙皮”扁桃油最佳提取條件的確定及驗證實驗

通過響應面法優化得到的“紙皮”扁桃油水酶法最佳提取工藝參數為：酶解pH為3.81、料液比為1∶5.135、酶添加量為果膠酶:水解蛋白酶 (237.5 U∶1 187.6 U/g)、酶解溫度為47.59 ℃，在此條件下“紙皮”扁桃的預測出油率為56.67%。為了驗證該結果的可靠性，進行3次平行實驗驗證，結果取平均值，所得“紙皮”扁桃實際出油率為60.73%。實際驗證值與理論預測值相比，相對誤差6.68%，表明響應面優化后的“紙皮”扁桃油水酶法提取工藝可行，具有一定的實際利用價值。

3 結論

本研究利用水酶法提取“紙皮”扁桃油，通過單因素實驗和響應面優化，得到水酶法提取“紙皮”扁桃油的最佳工藝參數為：選取果膠酶和水解蛋白酶，果膠酶和水解蛋白酶添加比例為1∶5(酶活性)、在酶解pH為3.81、料液比為1∶5.135、酶添加量為果膠酶∶水解蛋白酶=237.5 U∶1 187.6 U/g、酶解溫度的為47.59 ℃、酶解時間3 h的條件下，“紙皮”扁桃的出油率可達60.73%