小分子化合物靶向DNA 連接酶IV 提高CRISPR/Cas9 基因編輯效率的研究進展

肖紅衛，畢延震

（動物胚胎工程與分子育種湖北重點實驗室/湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所，武漢 430064）

能夠在DNA 鏈上制造特定位點雙鏈斷裂（Double-strand breaks，DSB），并利用細胞的DNA 修復功能進行修復的技術被稱之為基因編輯技術，常見的基因編輯技術有鋅指核酸酶（Zinc-finger nucleases，ZFN）、轉錄激活因子樣效應物核酸酶（TAL effector nucleases，TALEN）和CRISPR/Cas9 等，理論上基因編輯技術可以對任意細胞類型的任意基因進行定點改造。前人在研究DNA 損傷修復時發現，真核細胞會對DNA 的DSB 進行同源重組（Homologous directed recombination，HDR）、非同源末端連接（Nonhomologous end joining，NHEJ）的選擇性修復，在選擇HDR 修復時會依照模板進行精確地修復，而在選擇NHEJ 修復結束后在這些DSB 位點造成局部的缺失、插入，甚至無關聯位置末端連接等［1］。

科學家們在研究DNA 修復過程時發現，NHEJ與HDR 之間相互競爭，互為替代DNA 修復途徑［2，3］。Pierce 等［4］研究發現，NHEJ 與HDR 2 種途徑同時起作用，NHEJ 活性降低會增加HDR 效率。小分子化合物在DNA 修復的HDR 通路與NHEJ 通路的選擇上發揮作用，并以此為指導產生了以小分子化合物來提高基因編輯效率的一系列研究。本研究通過綜述分析小分子化合物在DNA 修復中NHEJ 通路中發揮的作用機制，說明小分子化合物提高CRISPR/Cas9 基因組編輯的研究進展，為基因的精確編輯提供理論依據。

1 DNA 修復中的HDR、NHEJ 機制

DNA 雙鏈斷裂的修復對于細胞維持其基因組完整性至關重要。修復哺乳動物細胞中這些斷裂的2 個主要機制是非同源末端連接和同源重組。圖1為NHEJ 與HDR 之間相互競爭、互為替代DNA 的修復途徑［2，5，6］。

1.1 HDR 機制

HDR 在 細 胞 的S 期 起 作 用。 首 先，DSB 被MRN（Mre11p/Rad50p/Nbs1p）復合體識別，接著招募RecBCD 復合體進行DSB 斷端處理，斷端從5′-3′降解核苷酸，形成3′端單鏈DNA（ssDNA）。3′端單鏈DNA（ssDNA）在RecA 的作用下調整和侵入另外一條同源鏈從而進行后續的DNA 分子交換，形成HJ模型（Holliday Junction）。然后在RecA 和DNA 聚合酶的作用下進行DNA 堿基互補配對、DNA 合成及延伸。接著發生HJ 模型交叉支點的遷移和切斷。最后，2 個雙鏈DNA 解離，DNA 連接酶連接DNA 斷端，得到2 個獨立完整的雙鏈DNA［5］。圖2為HDR 修復途徑的步驟以及各因子參與該過程的順序［6］。

圖2 DNA 損傷HDR 修復過程

圖1 NHEJ 與HDR 之間相互競爭、互為替代DNA 的修復途徑

1.2 NHEJ 機制

NHEJ 在整個細胞周期中都起作用，并且DSB被Ku70/Ku80 異二聚體識別，該異二聚體結合在斷裂兩側的DNA 末端。這種異二聚體的形成導致DNA 依賴性蛋白激酶（DNA-PK）的催化亞基的活化。DNA-PKcs 與Ku70 和Ku80 結合并穩定DNA的末端。穩定后，DNA 連接酶IV（DNA ligase IV，LIG IV）/XRCC4 復合物結合并將DNA 的末端連接在一起，從而修復了DSB［7，8］。由于HDR 效率很低（＜5%），大部分DSB 都由NHEJ 修復完成，從而引進許多隨機的插入和缺失。此外，HDR 的效率還與細胞的類型與狀態等因素相關。 在S/G2 期間，NHEJ 和HDR 之間的路徑選擇受DSB 位點的最終處理程度影響［9］。圖3 為經典NHEJ 途徑的步驟以及各因子參與該過程的順序［10］。

圖3 經典NHEJ 途徑的步驟以及各因子參與該過程的順序

在脊椎動物細胞的NHEJ 途徑中，除了MRN（Mre11p/Rad50p/Nbs1p）復合體以外，DNA 依賴性蛋 白 激 酶Ku70p、Ku80p、DNA-PKcs、Xrcc4p 和DNA ligase IV 的3 個亞基均參與非同源末端結合途徑。自從Chu 等［11］發現使用DNA ligase IV 的小分子化合物抑制劑SCR7 來抑制樣品的NHEJ 后可以提高HDR 的效率以來，相關研究不斷深入。

2 小分子化合物通過抑制NHEJ 通路中的DNA 連接酶IV 提高HDR 通路的效率

DNA 連接酶IV 由與C 末端串聯BRCT 結構域連接的N 末端催化結構域組成［12］。DNA ligase IV中的串聯BRCT 結構域與XRCC4 的莖區域以高親和力相互作用，從而穩定了DNA ligase IV［13，14］。所有細胞DNA ligase IV 都可能與XRCC4 復合存在［15，16］。

DNA ligase IV 在ATP 依賴性反應中與雙鏈多脫氧核苷酸中的單鏈斷裂連接。 該蛋白質通過NHEJ 對V（D）J 重 組和DSB 的修 復是必需的。DNA ligase IV 負責在NHEJ 期間密封DSB。已知XRCC4 和DNA-PK 都是NHEJ 所必需的，抑制DNA ligase IV 可導致DSB 的聚集［17，18］。

2.1 SCR7

2.1.1 SCR7 的作用機理 Srivastava 等［19］研究發現一種分子（SCR7）可以抑制DSB 在無細胞修復系統中的連接。DNA ligase IV 蛋白與X 射線修復交叉互補蛋白4（XRCC4）形成復合物，并進一步與DNA依賴性蛋白激酶（DNA-PK）相互作用。 XRCC4、DNA-PK 蛋白上沒有SCR7 分子可以結合的結構域，在DNA ligase IV 上存在DNA 以及SCR7 分子可以結合的結構域。SCR7 通過干擾其與DNA 結合而不是T4DNA 連接酶或連接酶I 的結合來阻斷DNA ligase IV 介導的連接。SCR7 分子與DNA 分子競爭性地結合在DNA ligase IV 蛋白上，從而在細胞內以DNA ligase IV 依賴性方式抑制NHEJ。采用ACD ChemSketch 軟件繪制了SCR7 的化學結構式，并采用Accelrys Discovery Studio 2.5 軟件模擬了SCR7 與DNA ligase IV 的互作結果（圖4）。

Maruyama 等［3］研究發現，通過增加外源DNA片段可以提高通過同源重組摻入基因組的速率，從而將靶向DSB 引入DNA，實現精確的基因組編輯。為了抑制NHEJ 促進HDR，使用了抑制劑SCR7 靶向DNA ligase IV（NHEJ 途徑中的關鍵酶）。在哺乳動物細胞系和小鼠中使用CRISPR/Cas9 技術對Kell、Igkc、Os9、Sgms2 4 個基因進行基因編輯，SCR7的處理提高了HDR 介導的基因組編輯效率，在對這4 個基因進行檢測時，使用SCR7 處理最高可以提高基因編輯效率達19 倍。該方法應適用于其他可定制的核酸內切酶，例如鋅指核酸酶和轉錄激活因子樣效應物核酸酶，以及具有足夠保守的NHEJ和HDR 機制的非哺乳動物細胞。Vartak 等［20］也發現，SCR7 通過抑制NHEJ 顯著提高了精確基因組編輯的效率，并且在體外和體內均有利于無錯誤的同源重組途徑。

圖4 SCR7 的化學結構式以及SCR7 與DNA ligase IV 互作的模擬

Chu 等［11］使用了抑制劑SCR7 將HDR 的效率提高了4～5 倍。Ma 等［21］研究發現，與NHEJ 途徑相比，CRISPR/Cas9 介導的HDR 指導的精確遺傳修飾效率相對較低，通過添加SCR7 來抑制DNA ligase IV 從而抑制NHEJ，可以增加HDR 介導的精確遺傳修飾效率。Hu 等［22］研究發現，在使用ssODNs 作為模板時，與沒有SCR7 處理的細胞相比，SCR7 處理使轉染細胞中的靶向插入效率提高了3 倍。而Lin等［23］研究發現，將抑制劑SCR7 引入CRISPR/Cas9系統促進了HSV-1 基因組中HDR 介導的基因置換，進一步驗證了Maruyama 等［3］、Vartak 等［20］的發現。

Li 等［24］研 究 發 現，小 分 子 化 合 物SCR7、L755507 和白藜蘆醇可使豬胎兒成纖維細胞的HDR 效 率 提 高2～3 倍。 當 用 同 源 模 板DNA 和CRISPR/Cas9 質粒轉染并用小分子處理時，具有大DNA 片段整合的敲入豬胎兒成纖維細胞系的比率可以達到篩選細胞集落的50% 以上，而用DMSO 處理的細胞組中敲入率為26.1%。結果提示，應該存在一類結構類的并且可以提高基因編輯效率的小分子化合物。而Vartak 等［25］研究發現，環化形式的SCR7 在體外顯示出對NHEJ 的強烈抑制，環化和氧化形式的SCR7 抑制DNA ligase IV 催化的DNA 末端連接，而它們對DNA ligase III、DNA ligase I 和T4DNA 連接酶介導的連接影響最小。環化和氧化形式的SCR7 均抑制V（D）J 重組，其中SCR7 環化的效果更明顯。SCR7-吡嗪對細胞內的連接酶IV的特異性較低。結果提示，對小分子化合物結構的分析很重要，并可指導相關化合物的合成。

2.1.2 CRISPR/Cas9 中使用的SCR7 劑量 在確認了SCR7 對HDR 效率的提升具有確切的作用后，眾多科學家對SCR7 的使用濃度進行了探索。Chu等［11］研究發現，10～60 mmol/L 的SCR7 均可有效地提高HDR 的效率。Maruyama 等［3］研究發現，使用1 mmol/L 的SCR7 注射胚胎可以提高HDR 介導的基因組編輯的效率7～19 倍。Lin 等［23］研究發現，SCR7 可以促進人類細胞中HSV-1 基因組上HDR介導的基因置換。Li 等［24］研究發現，10～200 μmol/L SCR7 不會影響細胞周期分布。用小分子處理的細胞中幾乎所有的HDR 途徑關鍵因子均表達上調。一些NHEJ 關鍵因素，如LIG4 和MRE11，在用L755507 或SCR7 處理后顯示出mRNA 表達水平的顯著降低，但是XRCC5、XRCC6 和XRCC7 這3 個NHEJ 修復通路中的關鍵因子在用SCR7、L755507以及Resveratrol 這3 種化合物處理的細胞中均表達上調。Hu 等［22］研究發現，與未使用SCR7 處理的細胞相比，采用SCR7 處理MCF-7 細胞和HCT-116細胞時，HDR 片段明顯增加。不同的研究采用的濃度不盡相同，卻都能成功完成，進一步證明了SCR7的作用。

2.2 NU7026

Gkotzamanidou 等［26］研究發現，用DSB 修復抑制劑處理細胞會顯著降低DSB 修復的比率并增加細胞對木香素的敏感性，而非同源末端連接抑制劑NU7026 和SCR7 表現出最強的作用。軟件分析后發現，NU7026 和SCR7 同處于DNA ligase IV 結合的結構域，推測在DNA 修復中NU7026 可能發揮和SCR7 同樣的調控作用。結合NU7026 處理細胞后可以增加細胞對木香素的敏感性，推測在進行多個小分子化合物聯合處理細胞時，NU7026 和SCR7 發揮了booster 的作用。采用ACD ChemSketch 軟件繪制NU7026 的化學結構式（圖5a），并采用Accelrys Discovery Studio 2.5 軟件模擬NU7026 與DNA ligase IV 的互作結果（圖5b），以及模擬NU7026、SCR7 與DNA ligase IV 的 互 作 結 果（ 圖5c）。NU7026 與SCR7 同處于DNA ligase IV 結合的同一個結構域。

2.3 白藜蘆醇

Li 等［24］研究發現，用白藜蘆醇處理細胞后，結果根據白藜蘆醇劑量的變化而變化。低濃度（小于25 μmol/L）白藜蘆醇可以抑制LIG4 和XRCC4 的表達。50 μmol/L 白藜蘆醇對LIG4 的表達沒有影響，或略微上調了XRCC4 的表達，而100 μmol/L 白藜蘆醇顯著促進了它們的表達。軟件分析后發現，白藜蘆醇和SCR7 同處于DNA ligase IV 結合的結構域，結合白藜蘆醇處理細胞后的結果，推測白藜蘆醇與SCR7 可能另外調控DNA 修復的作用機制。采用ACD ChemSketch 軟件繪制白藜蘆醇的化學結構式（圖6a），并采用Accelrys Discovery Studio 2.5 軟件模擬白藜蘆醇與DNA ligase IV 互作結果（圖6b），并模擬白藜蘆醇、SCR7 與DNA ligase IV 互作的結果（圖6c）。白藜蘆醇與SCR7 同處于DNA ligase IV 結合的同一個結構域。

2.4 L755507

Li 等［24］研究發 現，用L755507 處 理 細胞 后，LIG4 和MRE11 的mRNA 表達水平顯著降低，而XRCC5，XRCC6 和XRCC7 表達水平均上調。軟件分析后發現，L755507 沒有和SCR7 同處于DNA ligase IV 結合的結構域，推測L755507 可能另外調控DNA 修復的作用機制。采用ACD ChemSketch 軟件繪制的L755507 的化學結構式，并采用Accelrys Discovery Studio 2.5 軟 件 模 擬L755507、SCR7 與DNA ligase IV 互作結果。 L755507 遠離SCRT 與DNA ligase IV 作用的結構域（圖7）。

3 其他研究

圖5 NU7026的化學結構式（a）、NU7026與DNA ligase IV互作結果（b）、NU7026、SCR7與DNA ligase IV互作結果（c）的模擬

圖6 白藜蘆醇的化學結構式（a）、白藜蘆醇與DNA ligase IV 互作結果（b）以及白藜蘆醇、SCR7 與DNA ligase IV 互作結果（c）的模擬

圖7 L755507 的化學結構式以及L755507、SCR7 與DNA ligase IV 互作結果的模擬

科學家們除了使用NHEJ 的小分子化合物抑制劑來抑制NHEJ 以提高HDR 的效率之外，還針對參與NHEJ 通路的各個蛋白開展了相關功能研究。Song 等［27］研究發現，HDR 增強子RS-1 的體外應用在不同位點將敲入效率提高了2～5 倍，而NHEJ 抑制劑SCR7 卻只能提高2.3% 的基因編輯效率。提示除了SCR7 抑制劑之外，還有別的途徑可以提高HDR 的效率。Yang 等［28］研究發現，G2/M 中的hPSCs 與ABT 階段同步增加了目標基因編輯效率3～6倍。靶向基因編輯的增加是基因座獨立的并且對細胞周期階段是特異性的，因為與G1 期細胞相比，G2/M 期富集的細胞顯示靶向效率增加6 倍。同時用SCR7 抑制NHEJ 不會增加HDR 或進一步提高基因靶向效率，表明HDR 是G2/M 期阻滯后的主要DNA 修復機制。Shao 等［29］研究發現，通過表達參與同源重組過程的基因Rad52 可以增強HDR 效率。Rad52 共表達和 Rad52-Cas9 融合策略在人HEK293T 細胞以及基因組編輯中HDR 效率增加了約3 倍。此外，還證實了Rad52-Cas9 融合對由不同供體模板（質粒、PCR 和ssDNA）介導的HDR 的增強作用，并發現通過Rad52 和SCR7 組合使用，HDR 效率可以顯著提高到約40%。

4 展望

自從基因編輯技術出現后，在基因功能的研究上日益深入。該技術可以很方便地在DNA 鏈上產生DSB，并利用細胞自身的DNA 修復中的NHEJ 機制，在靶基因座位上產生突變；或者利用DNA 修復中的HDR 機制，把目的基因定點插入靶基因座位。該技術克服了傳統轉基因技術的整合隨機、遺傳不穩定等缺陷，具有很大的應用前景。尤其是在利用DNA 修復中的HDR 機制把目的基因定點插入靶基因座位的研究上，人們可以采用基因編輯技術，把一些藥用蛋白基因敲入乳腺特異表達基因區或者輸卵管特異表達基因區，使牛羊乳中產生藥用蛋白或者雞蛋中產生藥用蛋白?；贑RISPR/Cas9 的基因編輯系統的研究最為簡單和便宜，得到廣泛的應用和推廣，但因為細胞內的NHEJ 與HDR 的競爭，導致HDR 效率比較低。該問題的解決需要科學家們共同攻關，研究高效的編輯手段、篩選技術和轉移方法，以促進基因編輯技術的進一步推廣和應用。

利用小分子化合物靶向DNA 連接酶IV 抑制NHEJ、提高HDR 效率是熱門研究的方向之一。利用篩選出的小分子化合物，不管是在DNA 修復機制研究上還是在生物工程研究上，都具有很高的價值。而該研究方向的關鍵點就是在參與DNA 修復NHEJ 途徑的DNA 連接酶IV 上，一旦篩選出高效的DNA 連接酶IV 抑制劑，就會促進基因編輯技術在生產上的應用。