水稻稻曲病菌侵染行為的研究現狀及展望

胡賢鋒，王 健，李 明，李榮玉，3

(1.貴州大學 作物保護研究所，貴州 貴陽 550025； 2.貴州大學 農學院，貴州 貴陽 550025；3.貴州省山地農業病蟲害重點實驗室，貴州 貴陽 550025)

稻曲病(Rice false smut)是由稻曲病菌(有性態為Villosiclavavirens，無性態為Ustilaginoideavirens)侵染水稻小穗引起的穗部病害[1]。近年來，由于我國雜交水稻大面積推廣和稻田肥水水平提高，稻曲病由歷史上的次要病害演變為當前水稻生產上“新三大病害”之一[2]。此外，稻曲病不僅危害糧食產量，稻曲病菌產生稻曲菌素對動物微管蛋白組裝和細胞有絲分裂具有較強抑制作用，嚴重影響稻米食用安全[3-4]。由于稻曲病研究起步晚，稻曲病菌在人工培養條件下菌絲生長十分緩慢，加之稻曲球為唯一可見病狀，發病受氣候條件影響大，且其侵染機制獨特等制約了稻曲病深入研究，導致關于稻曲病的諸多理論問題不明晰，特別是侵染循環過程中初侵染源、侵染機制等存在爭議[5-7]。研究人員在定量抗性位點分析等方面做了大量工作，但未鑒定出抗稻曲病菌水稻抗性基因[8-9]。因此，當前對稻曲病仍缺乏抗性較好的品種。鑒于此，從稻曲病菌的接種體系、初侵染源、侵染關鍵期、侵染位點、侵染過程、侵染機制等方面對國內外的研究進展進行綜述，以期為進一步明確稻曲病菌致病機制，并為稻曲病抗性品種選育、防控藥劑特異性靶標選擇以及防控策略制定等提供理論參考。

1 水稻稻曲病發生與危害

稻曲病1878年在印度首次被報道，而在我國明朝就有“硬谷奴，谷穗霉者”的記載，實際就是對稻曲病的最初認識[10]。該病害在孟加拉國、日本、中國等40多個國家的水稻主產區普遍發生[11-14]。稻曲病在我國各稻區普遍發生，但每年發生嚴重程度差異較大，主要由于該病發生常受氣候、品種及栽培等因素影響[15]。稻曲病產生稻曲球導致水稻收割時夾雜大量病粒，同時稻曲病菌劫持水稻營養物質形成稻曲球，致使秕谷增多，千粒質量下降，減產10%～50%[16]。稻曲病菌主要產生黑粉菌素和綠核菌素2類次生代謝產物[17]?，F已在稻曲菌中分離鑒定了 26 種黑粉菌素：黑粉菌素 A、B、B1、C、D、E、E1、F、G、H、I、J、K、L、M、N、O、P、Q、R、S、T、U、V、W和3，4-二氫黑粉菌素T[18-19]。其中，黑粉菌素是一類可破壞真核生物有絲分裂的水溶性無色物質，對動植物細胞具有毒性，研究人員將稻曲球研磨成粉末拌飼料飼喂后，能夠導致雞、兔內臟器官病變[20-21]。

2 水稻稻曲病菌侵染行為

2.1 水稻稻曲病接種體系構建

當前，缺乏高效穩定引發稻曲病的人工接種技術仍是限制稻曲病深入研究的重要因子。迄今，多數研究者認為，在水稻破口前7 d，通過注射器將菌絲孢子混合液注入水稻穗苞并作保濕處理能夠引發稻曲病。張君成等[22]通過人工接種稻曲病菌，發現液體培養獲得薄壁分生孢子可引發稻曲病，分生孢子濃度越高，病穗率越高。其中，孢子菌絲混合液接種發病最嚴重，病穗率高達100%，最大病情指數為93.96%。LU等[23]的研究也表明，采用高速勻漿機將稻曲病菌菌絲和孢子打碎，制備菌絲孢子混合液，可引發稻曲病。因此，當前大多數研究人員采用稻曲病菌菌絲孢子混合液作為接種體。此外，JIA等[24]在室內控制條件下進行人工接種試驗，比較不同幼穗分化期、溫度、保濕時間等對發病率的影響，發現幼穗分化后期接種稻曲病菌發病率最高，同時，溫度和濕度對稻曲病發病率影響較大，28 ℃條件下病穗率顯著高于20 ℃。ASHIZAWA等[25]也報道，溫度和濕度是引發稻曲病的重要因子，室內人工接種后16 ℃保持2 d，然后在100%濕度條件下保濕5 d，最有利于稻曲病發生。而胡東維等、WANG等[26-27]將白化菌株注射入水稻穗苞，其發病率顯著高于噴霧接種，并且適當的低溫刺激能夠促進稻曲病的發生。在室內控溫控濕條件下，用注射器將稻曲病菌分生孢子液注入水稻穗苞常具有較高發病率，但該方法并不能真正意義上模擬稻曲病菌田間自然侵染，難以解釋田間稻曲病菌的真正侵染途徑，不能真實反映水稻品種對稻曲病菌的抗性水平，因此，建立高效穩定的可模擬田間自然侵染的稻曲病菌人工接種體系，對研究其侵染途徑及水稻抗性品種選育具有重要意義。

2.2 水稻稻曲病初侵染源

關于稻曲病菌的主要初侵染源尚存在爭議。菌核在適宜條件下可萌發形成子座，子座產生子囊孢子，進而萌發產生分生孢子；厚垣孢子在適宜條件同樣可產生分生孢子。菌核、厚垣孢子及種子帶菌引發稻曲病均有報道[28-30]。有研究人員認為菌核是稻曲病菌主要的初侵染源：菌核越冬后在適宜的溫濕度條件下萌發產生子囊孢子，子囊孢子萌發產生分生孢子侵染水稻花器官，厚垣孢子主要在稻曲病菌再侵染過程中起重要作用[31]。YONG等[32-33]研究發現，亞熱帶稻曲病菌可產生大量菌核，且單個稻曲菌便可產生大量子囊孢子，所以，即使僅有少量菌核萌發，也可產生大量初侵染源；此外，水稻抽穗時，利用孢子捕捉器可在溫帶和亞熱帶捕捉到子囊孢子。另有研究人員認為厚垣孢子才是主要的初侵染源，在我國河北等地很少發現菌核，且菌核在土壤中易潰爛[34]。IKEGAMI[35]用厚垣孢子接種水稻穗苞，能夠導致水稻發病。姚琳等[36]將稻曲球分別置于4、-20 ℃條件下，8個月后檢測其萌發率，4 ℃條件下保存的厚垣孢子萌發能力較強，可成為來年初侵染源。高必達等[37]認為田間越冬后的菌核和厚垣孢子是稻曲病的主要初侵染源，菌核和厚垣孢子萌發后產生子囊孢子和分生孢子，隨雨水進行傳播。劉見平等[38]則認為，種子帶菌是稻曲病菌的主要初侵染源?？傊?，形成菌核或厚垣孢子是稻曲病菌越冬的重要方式，厚垣孢子和菌核在適宜的溫濕度條件下均能形成分生孢子，侵染水稻花絲，最終形成稻曲球。因此，可通過調查越冬后田間菌核或厚垣孢子基數，或在侵染前期采用LAMP(Loop-mediated isothermal amplification,環介導等溫擴增)等快速檢測方法評估菌源數量，加強稻曲病的發生和危害預測預報。

2.3 水稻稻曲病侵染時期

明確稻曲病菌最佳侵染時期對確定其防控最佳時期具有指導意義。稻曲病的典型癥狀是在穗部形成稻曲球，故大多數研究人員認為，水稻孕穗期至破口期是稻曲病菌侵染的關鍵時期，但也有部分研究人員認為，稻曲病菌可能在水稻整個生育期潛伏。前人為了摸清稻曲病菌的最佳侵染時期做了大量研究工作。張震等[39]通過對稻曲球解剖，發現典型的稻曲球均可解剖出完整子房，由此推測稻曲病菌侵染水稻小穗發生在水稻開花之前，并直接從子房獲得營養形成稻曲球。TANG等[2]也有相似報道，成熟稻曲球中含有6個完整花藥，推測稻曲病菌主要侵染時期可能是在水稻花器官形成之后、水稻揚花之前。汪愛娟等[40]在稻株“葉枕平”(即水稻孕穗末期)用藥具有較高防效，由此推測水稻孕穗期可能是稻曲病菌侵染的主要時期。李陽[41]用稻曲病菌在水稻芽期、三葉期、圓稈期和孕穗期進行接種試驗，同時用稻曲病特異性PCR進行檢測，發現自接種后每個發育時期均可檢測到稻曲病菌的存在，推測稻曲病菌可寄生于水稻體內潛伏。陳永堅等[42]用厚垣孢子粗提液處理水稻苗期根系、苗期葉、芽鞘、種子，其病穗率分別為9.68%、2.58%、3.95%、2.04%，推測水稻整個生育期均可受到病原菌侵染。郭榮華等[43]在水稻生長幾個關鍵時期用厚垣孢子懸浮液分期噴霧，發現處于破口初期的嫩穎最易遭到侵染，且田間藥劑試驗表明，在破口前7 d施藥防效最高，推測稻曲菌可能的最佳侵染時期是在水稻破口前7 d。大量的人工接種試驗表明，稻曲病菌在幼穗形成后即水稻穗苞破口前7 d為主要侵染時期，這已得到大多數研究人員認可。

2.4 水稻稻曲病侵染過程

為了探明稻曲病菌侵染水稻的過程，研究人員對稻曲病菌菌株進行標記與追蹤，取得了新突破，發現稻曲病菌首先附著在水稻穎殼，進而侵染相應花器官。代光輝等[44]利用熒光顯微鏡對稻曲病菌分生孢子侵染途徑進行觀察，發現稻曲病菌分生孢子首先在穎口萌發產生菌絲，稻曲病菌菌絲沿穎口進入穎內。蔡洪生等[45]采用稻曲病菌孢子液對水稻進行人工接種后，發現菌絲最先在花絲和花藥上出現，之后才出現在柱頭上。鄭大偉等[46]研究發現，稻曲病菌侵入水稻小穗后，首先出現在花藥表面，后擴展至小穗基部。ASHIZAWA等[11]采用GFP(Green fluo-rescent protein,綠色熒光蛋白)標記菌株接種水稻穗部，實現了對稻曲病菌可視化追蹤觀察，發現稻曲病菌菌絲可通過水稻穎殼間隙入侵，隨后稻曲病菌開始侵染水稻某些重要花器官。CHAO等[47]將稻曲病菌侵染分為3個階段：稻曲病菌侵染雌蕊和柱頭、擴展至雄蕊基部、包裹花器官后進入花藥室產孢。雍明麗[48]研究發現，稻曲病菌易附著在幼根，在根系表皮細胞間隙可檢測到稻曲病菌，但30 d后仍未發現稻曲病菌刺破厚壁組織層進入根的韌皮部，說明稻曲病菌很難通過附著在水稻根部進而達到穗部進行侵染。SONG等[49]研究發現，稻曲病菌的侵染過程是逐步的，稻曲病菌的侵染模式不同于經典的稻瘟病菌侵染模式(常以水稻葉片等作為侵染對象)，稻曲病菌通過穎殼間隙進入穎內后，首先攻擊水稻花絲，阻止水稻花粉的成熟，同時阻斷子房受精后劫持其營養庫進而形成稻曲球，初步揭示了稻曲病菌的侵染過程。然而，稻曲病菌與花絲間的識別機制和形成稻曲球的營養物質來源尚不明晰，揭開稻曲病菌與花絲之間相互識別的生理生化機制、摸清稻曲病菌如何激發水稻相關灌漿基因的表達進而獲取營養物質形成稻曲球可能是將來的研究方向。

2.5 稻曲病菌分子生物學

隨著分子生物學技術的快速發展，稻曲病菌的侵染機制研究也得到長足進步。當前，已完成了稻曲病菌全基因組測序，并進行了致病相關基因的克隆與功能以及水稻響應稻曲病菌等相關研究。ZHANG等[50]對標準菌株Uv-8b進行測序，完成了標準菌株Uv-8b全基因組序列草圖繪制，通過基因序列比對發現，稻曲病菌基因組中缺乏果膠分解酶基因，這可能與稻曲病菌獨特的侵染方式有密切關系，從分子水平解釋了稻曲病菌獨特的侵染方式，并預測了193個富含半胱氨酸的蛋白質和628個分泌蛋白，以及與稻曲病菌次生代謝物質合成相關的重要因子。KUMAGAI等[51]對菌株IPU10進行全基因組測序，并預測了6 451個蛋白質。全基因組測序的完成為同源基因的克隆與功能研究帶來極大便利。FAN等[12]在接種稻曲病菌后對水稻小穗進行轉錄組分析，發現調控水稻灌漿的基因RISBZ1和RPBF等被激活表達，而調控水稻開花的轉錄因子ARF8和ARF6等被抑制表達，且與水稻防御相關的相關基因NPRI和PRI出現下調表達，推測稻曲病菌能夠激活灌漿基因的表達，從而獲得大量營養物質形成稻曲球。研究人員通過比較稻曲病抗性品種IR28和感病品種黃華占接種后的轉錄組，在IR28和黃華占上分別找到1 405、1 066個差異表達的基因，這些差異表達的基因對過氧化物酶基因的差異性調控、次生代謝等起到重要調控作用[52]。當前，通過T-DNA隨機插入的方法，獲得了與稻曲病菌孢子形成和菌絲生長和致病性相關基因的插入突變體UvSpo76、Uvt-726、UvSUN2、UvT-B1464R和Uvt-1241，并通過定向敲除或RNAi的方法明確了UvHOG1、UvPRO1、Uvt3277和UvSLT2基因的功能。其中，UvSLT2基因主要產孢量與應激反應相關[53]，UvHOG1參與次級代謝[6]、菌絲生長和應激反應，UvPRO1和Uvt327參與孢子形成、菌絲生長，與致病性相關[7，54]。上述研究結果對于分離水稻抗稻曲病QTL(Quantitative trait locus,數量性狀基因座)及選育水稻抗性品種具有重要意義。在以后研究工作中可針對稻曲病菌特異性侵染過程研究其功能基因，明確相關致病基因作用機制，也是快速摸清稻曲病菌致病機制的有效途徑。

3 展望

稻曲病已成為我國水稻生產上嚴重影響稻米品質與產量的重要病害。關于稻曲病的研究起步較晚，且其發病受氣候條件影響大，加之稻曲球為唯一可見病狀，其侵染機制獨特等因素制約，導致稻曲病相關研究尚不深入[26，55]。當前，人工注射接種是稻曲病菌接種試驗中廣泛運用的接種方法，但該方法不能解釋田間稻曲病菌的真正侵染途徑，難以反映水稻品種對稻曲病菌的真實抗性水平。田間稻曲病菌可通過形成菌核或厚垣孢子越冬后萌發產生分生孢子形成侵染源，在水稻穗苞破口前7 d從水稻穎殼間隙進入穎內，通過侵染花絲抑制水稻花粉的成熟，同時阻止子房受精后劫持其營養庫進而形成稻曲球，初步揭示了稻曲病菌的侵染過程。與此同時，稻曲病菌全基因組測序已經完成，并進行了相關致病基因克隆與功能分析及水稻響應稻曲病菌等相關研究。明確了稻曲病菌侵染行為，對稻曲病抗性品種選育、防控藥劑篩選以及防控策略制定具有重要意義。目前，對稻曲病的研究仍然有許多工作要做，以下幾個方面可作為以后研究方向的參考。

(1)當前接種方法并不能真正意義上模擬稻曲病田間自然感病，故難以闡明田間自然發病真正的侵染途徑。因此，建立高效穩定可真正模擬稻曲病菌自然感病的接種體系具有重要意義。

(2)稻曲病菌首先選擇水稻花絲作為攻擊目標，但稻曲病菌與花絲之間識別生理生化機制尚不明了，揭開稻曲病菌與花絲之間的相互識別機制，可為防控藥劑開發靶標的選擇和防控策略的制定提供依據。

(3)稻曲病菌能夠產生大量的稻曲菌素，該毒素在稻曲病菌侵染過程中的作用鮮有報道，可研究其在稻曲病菌侵染水稻過程中的作用。

(4)稻曲病菌如何激發水稻相關灌漿基因的表達進而獲取營養物質形成稻曲球可能是將來的研究方向。

(5)往往在產生稻曲球后才發現稻曲病已發生，常導致錯過最佳的防控時期。因此，在侵染前期可使用LAMP等快速檢測方法評估菌源數量，以加強稻曲病發生和危害的預測預報。