農桿菌介導棉花遺傳轉化的影響因素

李靜　張換樣　朱永紅　吳慎杰　焦改麗

摘? ?要? ?分析了農桿菌介導的棉花遺傳轉化的影響因素：棉花基因型是影響體細胞胚胎發生的關鍵因素;培養1周且分化不成熟的棉花下胚軸是誘導胚胎發生的首選外植體;高比值的KT/2，4-D可有效誘導胚性愈傷組織的產生，低比值則可以促進體細胞胚胎發生;葡萄糖比麥芽糖更適合誘導產生愈傷組織。在轉化過程中，胚性愈傷是農桿菌侵染較合適的原始轉化材料;菌液的培養溫度、濃度、侵染時間及乙酰丁香酮（AS）濃度都會影響組織的轉化效率;合適的抗生素濃度也是抗性愈傷篩選的必要保證。

關鍵詞? ?棉花;農桿菌介導法;遺傳轉化;誘導培養;影響因素

中圖分類號：S562? ? 文獻標志碼：C? ? DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2020.22.002

棉花（Gossypium spp）是世界上最重要的經濟作物之一，在全球經濟中扮演重要角色，棉花纖維是紡織業的重要原料，棉稈和棉籽等都可以用作生物質能源原料。棉花屬于錦葵科（Malvaceae）棉花屬（Gossypium），該屬有超過50個種，廣泛栽培的有4個種，其中陸地棉（Gossypium hirsutum L.）的種植面積超過全球棉花種植面積的90%。雖然傳統育種技術在提高棉花產量、纖維品質、棉籽油品質和高溫耐受能力等方面取得了較大的成功，但常規育種方法得到的棉花品種不同程度地存在種子活力低、易受蟲害草害影響、生長發育偏慢、易發生莖枯病等問題。轉基因方法可以通過直接或間接轉化手段，有目的地向棉花體內引入控制性狀遺傳的優良基因，實現生物性狀的定向改變，從而提高棉花產量，改良纖維品質，增強植株抗蟲、抗除草劑、抗病能力和抗逆性。

1987年，Umbeck、Firoozabady等先后報道了通過農桿菌介導法將新霉素磷酸轉移酶（NPTII）作為選擇標記基因轉入珂字棉312和珂字棉210[1-2]。隨后農桿菌介導的體細胞胚發生轉化法成為國際上普遍使用的棉花轉化手段。傳統的農桿菌介導法常用下胚軸或子葉作為受體，從共培養開始，在選擇培養基上產生數百個獨立轉化事件的愈傷組織，愈傷組織經過胚胎誘導及體細胞胚向正常植株發育和萌發，最終長成再生植株，這種多步驟的轉化周期較長（一般為10～12個月），轉化效率較低。

近年來，不少研究發現胚性愈傷組織作為受體感染農桿菌時，恢復自身正常生長和存活需要更少的時間，縮短了整體培育周期，轉化效率更高[3-4]。與下胚軸和子葉相比，胚性愈傷組織可能是更好的原始轉化材料。這種方法與其他棉花轉化方法相比，更加簡單、可靠和高效，省時省力。

本文主要從以下兩方面分析通過農桿菌介導法侵染獲得再生植株的影響因素：愈傷組織誘導和體細胞胚胎發生的影響因素;農桿菌介導愈傷組織遺傳轉化的主要因素。

1 愈傷組織誘導和體細胞胚胎發生的影響因素

體細胞胚胎發生是體細胞被重新編程發育成類似受精卵形成的胚胎的過程。體細胞胚胎發生有直接發生、間接發生兩種形式。在直接發生方式中，外植體的單個細胞直接發育成胚的類似物;間接發生方式中，體細胞胚的形成要經過一個脫分化過程形成愈傷組織。1979年，Price和Smith[5]首次報道了從克勞茨基棉花的細胞懸浮培養中獲得了體細胞胚。1983年，Davidonis、Hamilton[6]首次從陸地棉中獲得完整的再生植株。棉花體細胞胚胎是獲得完整轉基因植株的關鍵，這個過程較為復雜，受細胞內、外多種因素影響，主要包括內在因素（植物基因型、外植體類型等）和外在因素（培養基成分、外源生長調節因子等）。

1.1 內在因素

1.1.1 基因型

基因型是影響體細胞胚胎發生的主要因素[7]，影響體細胞胚胎發生的其他因素都取決于棉花基因型。眾多研究表明，不同棉種、同一棉種不同品種的胚胎發生和植株再生能力差異很大，在誘導體細胞胚時所需用的生長調節劑濃度和培養條件等差別也很大[8]。為了研究基因型對體細胞胚胎發生的影響，Trolinder將38個栽培種分別用4種生長調節劑組合方式處理，在所有生長調節劑處理中珂字312的胚胎發生率最高，隨后是珂字304、珂字315和珂字310，其余基因型在所有生長條件下的胚胎發生能力較差[9-10]。目前國內外許多實驗室均從珂字棉得到了較多的再生植株，珂字棉已成為棉花組織培養的模式品種，廣泛應用于棉花組織培養及其遺傳轉化等研究中。也有一些研究發現非珂字棉品系如岱字棉[11]、中國培育品種YZ-1[12]的胚胎發生率也很高。

在四大栽培種中，陸地棉體細胞胚胎發生較易，亞洲棉次之，海島棉和非洲棉較差[13]。棉花體細胞胚胎發生和植株再生是一種受多基因控制的遺傳特性，選育新品種時可以珂字棉為親本進行系統或雜交選育，將這些基因傳遞給育出的新品種，這樣就會保留住親本中的體細胞胚胎發生能力和植株再生能力[14]。

1.1.2 外植體

成熟組織（莖、葉、根、葉柄）和非成熟組織（子葉、下胚軸、地上分生組織）都可作為外植體誘導體細胞胚胎生成[15]。一般而言，內源生長素含量較多的外植體更易生成胚胎[16]，不成熟的外植體可能由于含有較高水平的內源生長素而比成熟組織擁有更強的胚胎發生能力。Trolinder和Goodin以生長3 d的珂字棉312為材料，比較了多種外植體胚胎發生能力，結果表明下胚軸最易誘導體細胞胚胎發生，中胚軸和上胚軸次之，種子和子葉較差，葉片和莖段最差。Sakhanokho等研究也發現下胚軸比子葉更易誘導胚胎發生，并首次用下胚軸和子葉培養出海島棉（G.barbadense L.）的再生植株[17]。子葉下胚軸作為外植體要比子葉所需的培養時間短，并且可阻止無性系變異的發生[18]。另外，下胚軸最易誘導出優良的愈傷組織[19]。很多研究者都是利用3日齡或6日齡的棉花無菌苗的下胚軸，切成3～5 mm的小塊進行愈傷組織的誘導。建議在棉花組培過程中最好選用無菌苗的下胚軸作為外植體。

1.2 外在因素

1.2.1 培養基組成和植物生長調節劑

高質量愈傷組織的形成是再生出完整棉花植株的關鍵因素，其中生長調節劑是最重要的影響因子。高比值的細胞分裂素/生長素可有效誘導胚性愈傷組織的產生。在幾個棉花品種中，2，4-D和NAA是更加有效的生長素類似物，雖然二者在誘導胚胎發生過程當中并無本質區別，但2，4-D可以更快速地誘導胚胎發生。2，4-D抑制胚性愈傷組織分化為胚狀體，因此在胚狀體生長的培養基中一般要去除2，4-D。所有細胞分裂素中，2iP和 KT在誘導胚胎發生中效果尤為顯著，2iP、KT分別與2，4-D共同使用時胚胎發生率可達到41.9%、23.5%。2，4-D+KT組合是棉花組織培養中的常用植物生長調節劑組合，廣泛用于棉花愈傷組織的誘導和體細胞胚胎發生中[20]。還有其他植物生長調節劑組合也被成功應用于不同棉花品種的體細胞胚胎發生，其中IBA+KT組合通常用來繼代培養胚性愈傷組織和促進體細胞胚胎發生，近年來也被成功應用于愈傷組織的誘導和分化調控[21]。

此外，還有一些其他生長調節劑，如IBA和IAA也是愈傷組織誘導時常用的生長素類似物，但之后需用NAA替換才能形成胚胎[22-23]。用子葉下胚軸作外植體可在以毒莠定為生長素源的培養基上獲得胚性愈傷組織。Benzyl amino purine （BAP）和2，4-D共同作用也可有效誘導胚性愈傷組織的形成[24]。也有報道稱只有兩種細胞分裂素而無生長素或只有兩種生長素類似物而無細胞分裂素的組合也可以誘導胚胎發生[25]。在所有方法中，Trolinder等、Firoozabady等采用的生長調節劑組合（0.1 mg·L-1 2，4-D+0.1 mg·L-1 KT，5.0 mg·L-1 2iP+0.1 mg·L-1 NAA）對于多種栽培種均可以獲得疏松的愈傷組織。大多數研究者在這兩種方法的基礎上依據培養條件和基因型，調整生長調節劑濃度來獲得胚性愈傷組織[26]。

1.2.2 碳源

碳源也是影響棉花愈傷組織誘導和體細胞胚形成的一個重要因素，難再生的棉花品種只能在某一特定的培養基里再生。在愈傷組織的誘導和增殖中最常用的是MSB培養基，即MS培養基的無機鹽與B5培養基的有機成分相配合的培養基。在培養基的碳源選擇上，棉花愈傷組織誘導宜用葡萄糖作為碳源，而胚性愈傷組織增殖、保存和胚狀體的萌發過程宜使用麥芽糖作碳源[27]，也有試驗表明4%的葡萄糖是誘導愈傷組織的最佳選擇。

2 農桿菌侵染胚性愈傷組織的影響因素

傳統的農桿菌介導法常用下胚軸或子葉作為受體，通過體細胞胚胎發生技術獲得再生植株。Wu等在培育抗蟲轉基因棉時發現轉化愈傷組織比轉化其他外植體（下胚軸、子葉）可減少6個月的時間。另外，胚性愈傷組織作為外植體時，Southern雜交分析表明大約有15%的轉化效率，平均每個培養皿能鑒定出8～12個陽性苗。Wu等采用該方法在短時間內每個愈傷組織獲得30～100個植株，GUS染色陽性率為72.60%[28]。因此，與子葉下胚軸或子葉相比，胚性愈傷組織可能是最好的原始轉化材料。農桿菌介導法成功運用主要依賴以下幾個因素：農桿菌將基因轉入特定基因組的轉化能力;轉化細胞的再生能力。這兩個因素又依賴于其他幾個影響因子，如基因型、外植體、農桿菌種類、乙酰丁香酮濃度等。

2.1 農桿菌菌株

農桿菌菌株對轉化效率影響很大。Sunilkumar和Rathore等用農桿菌侵染陸地棉子葉圓盤發現LBA4404的轉化效率明顯高于EHA105[29]。Tohidfar等用LBA4404、EHA101和C58侵染子葉和下胚軸時，LBA4404的轉化效率最高[30]。Leelavathi等、Wu等都利用農桿菌LBA4404侵染陸地棉胚性愈傷組織獲得轉基因棉。Jin等在轉化陸地棉胚性愈傷組織過程中也發現LBA4404的轉化效率遠高于C58C3。桿菌菌株如 AGL1、GV3111、GV3101也被用于轉基因棉的培養[31]。轉化陸地棉時推薦使用LBA4404菌株，轉化效率較高。

2.2 乙酰丁香酮（AS）

AS是受傷的植物組織分泌的酚類化合物，它能夠誘導Ti質粒中一系列Vir基因的表達[32]，這對于T-DNA的轉移是必須的。Sunilkumar等首次在棉花轉化時的農桿菌生長階段和共培養階段添加100 μM的AS，發現可以顯著提高珂字棉312和其他3個栽培種（TAM-94L25、TAM-89E51、TAM-94WE37S）的轉化效率[33]。Jin等在轉化胚性愈傷組織時設置了不同的AS濃度梯度，結果發現在50 mg·L-1（250 μM）時可顯著提高轉化效率;當AS濃度達到100 mg·L-1（500 μM）時，轉化效率降低[34]。Wu等在轉化時添加0、25、50、75 mg·L-1的AS，發現AS濃度為50 mg·L-1的轉化效率最高[35]。合適的AS濃度可以提高棉花轉化效率，但AS濃度高于500 μM時會降低轉化效率。綜上所述，共培養期間添加50 mg·L-1的AS時，轉化效率較高。

2.3 農桿菌感染濃度、感染時間

農桿菌感染濃度對轉化效率有很大的影響。Jin等報道侵染棉花愈傷組織時，菌液感染濃度OD600為0.5時的轉化效率比OD600為1.0或1.5時的轉化效率更高。大多數研究者在侵染愈傷組織時采用的農桿菌感染濃度OD600值為0.3～0.5，Wu采用OD600為0.2～0.3的菌液進行侵染。劉傳亮等構建棉花規?；D基因技術體系時，發現在原有轉化體系中，選擇的侵染濃度OD600值為0.3～0.7時，許多切段容易死亡，而適當降低菌液感染濃度OD600值至0.1～0.3可提高愈傷組織發生率，侵染15～20 min為宜。劉衛民等試驗表明侵染棉花下胚軸所用的農桿菌濃度OD600為0.4～05，侵染時間在10～15 min時，轉化效率最高，返菌率也很低;而侵染時間為20～30 min時，轉化率急劇下降，返菌率也顯著升高。綜上所述，農桿菌感染濃度OD600值為0.3左右時，轉化效率較高。另外，在壓力為186.158 kPa時，用農桿菌菌液真空滲入10 min可以顯著提高轉化效率，比常規轉化效率高出一倍多[36]。

2.4 共培養溫度和時間

Sunilkumar、Rathore和Jin等用可視化蛋白GFP作為標記，隨著時間觀察轉基因的定位，該技術可以幫助優化影響轉化效率的各種因素，尤其是共培養時間和溫度。此外，采用可視的篩選標記可以在早期輕易找到轉基因表達細胞系。試驗發現農桿菌侵染42～45 h后可觀察到GFP的表達，共培養3 d后GFP穩定且大量表達，4 d時所有細胞內均可檢測到GFP表達。但外源基因在轉基因材料中的瞬時表達和穩定表達是相關聯但又不同的，因為高水平的瞬時表達并不一定會導致高水平的穩定轉化。多數棉花轉化體系會采用48 h的共培養時間。Wu等通過GUS染色發現共培養48 h、72 h時，轉化效率并無差異。培養時間過長，愈傷組織會出現褐化和壞死現象，出愈率較低[37-38]。

共培養溫度也是影響轉化的重要因素。研究者對共培養溫度為21 ℃、25 ℃時，農桿菌LBA4404的轉化效率進行了研究，發現共培養溫度為21 ℃時，轉化效率更高。Wu等在研究農桿菌侵染陸地棉愈傷組織時，設置了19 ℃、23 ℃、26 ℃等3個共培養溫度梯度，結果發現共培養溫度在19 ℃時，轉化效率達到最高[32]。

2.5 抗生素

在農桿菌介導轉化法中，有兩類常用的抗生素，一類具有篩選作用，如卡那霉素和潮霉素;另外一類用來殺死農桿菌，如氨芐青霉素和頭孢霉素（500 mg·L-1）。在遺傳轉化中，很多基因以NPT II（抗卡那霉素）作為選擇標記基因，卡那霉素的使用濃度是影響轉化效率的一個重要因素。有研究表明，將卡那霉素濃度設為25 mg·L-1，愈傷組織呈淡黃色，生長迅速，成活率為98%～100%;濃度上升為50 mg·L-1時，愈傷局部生長速度變緩，成活率在80%以上;而當濃度提升至100～150 mg·L-1時，愈傷生長緩慢甚至停滯，成活率也下降至14%～40%。很明顯，高濃度抗生素對植物產生毒害作用，低濃度抗生素會導致非轉化細胞生長旺盛，再生受到抑制，無法對抗性愈傷起到篩選作用。棉花子葉和下胚軸作為外植體誘導胚性愈傷組織發生時，10 mg·L-1或更高濃度的卡那霉素使愈傷組織形成數量減少;濃度達到60 mg·L-1時，愈傷組織的生長、增殖和體細胞胚胎發生的誘導過程完全受到抑制。成熟的體細胞胚對卡那霉素不敏感，此階段很難篩選到轉化子[39]。

在轉基因的愈傷組織誘導和增殖階段，卡那霉素的最佳使用濃度為40～60 mg·L-1;而在篩選轉基因的胚性愈傷組織和體細胞胚時，卡那霉素的濃度應增加至200 mg·L-1。100 mg·L-1的卡那霉素篩選3次，7～8周，也能獲得很好的篩選效果。

另外，在培養基中原始愈傷組織的大小也會影響愈傷組織的出愈率，規格較大的愈傷組織更易存活下來。及時傳代培養及培養皿中愈傷組織的數量也會影響體細胞胚胎的發芽率，這是棉花組培中的一個重要步驟。因此，研究人員必須注意這些方面以提高整體轉化效率。

3 結語

近些年來，隨著轉化技術體系的不斷創新和完善，農桿菌介導的棉花遺傳轉化得以在全國范圍內推廣開來，呈規?；a。例如，中國農業科學院棉花研究所李付廣研究員主持的“棉花規?；D基因技術體系平臺的建設及其應用”有效組裝多種轉基因技術，實現了規?；?、高效率的棉花轉基因技術操作，年均獲得轉基因棉花植株6 000株以上，不僅降低了轉基因成本，還拓寬了受體的基因型范圍和外植體范圍?，F階段除了棉花下胚軸之外，葉柄、真葉和根等都可以通過農桿菌轉化獲得完整的轉基因植株，但有待進一步探究農桿菌介導的棉花遺傳轉化過程受眾多內在和外在因素的綜合影響的分子機制，以便將遺傳轉化應用于更多的商用棉花品種，減免雜交回交，縮短育種年限。

參考文獻：

[1] Trolinder N L， Goodin J R. Somatic embryogenesis in cotton （Gossypium） I. Effects of source of explant and hormone regime[J]. Plant cell tissue and organ culture， 1988， 12（1）： 31-42.

[2] 魏延宏. 農桿菌介導海島棉（Gossypium barbadense Linn.）遺傳轉化技術研究[D].石河子大學，2013.

[3] 芮存，李娟，曲延英，等.農桿菌介導的GbWOX9基因對海島棉胚性細胞的遺傳轉化[J].分子植物育種，2018，16（13）：4294-4300.

[4] 陸國清.農桿菌介導棉花的批量遺傳轉化及抗除草劑/抗逆轉基因棉花的培育[D].南昌：江西農業大學，2017.

[5] 趙振軍.LEC1對棉花體細胞胚胎發生的影響[D].石河子：石河子大學，2016.

[6] 馮克云.基因工程技術在彩色棉育種中的應用概況[J].甘肅農業科技，2008（2）：30-32.

[7] 耿立召，李付廣，劉傳亮，等.影響基因槍轟擊轉化棉花胚性愈傷的因素初探[J].棉花學報，2004，16 （6）：352-356.

[8] 耿立召.棉花基因槍遺傳轉化體系建立[D].北京：中國農業科學院，2004.

[9] Cousins Y L， Lyon B R， Llewellyn D J. Transformation of an Australian cotton cultivar： prospects for cotton improvement through genetic engineering[J]. Functional Plant Biology， 1991， 18（5）：481-494.

[10] 張海平.棉花轉基因體系的優化和抗黃萎病基因的轉化[D].杭州：浙江大學，2008.

[11] 李秋伶，王省芬，馬峙英，等.基因槍轟擊轉化棉花莖尖分生組織影響因素的探討[J].華北農學報，2006，21（S1）：32-36.

[12] 李雪.基因槍介導的棉花遺傳轉化及后代遺傳分析[D].保定：河北農業大學，2007.

[13] 劉傳亮，于婭，王玉芬，等.棉花基因槍莖尖轉化研究[J].棉花報，2003，15（6）：361-366.

[14] 劉德璞，袁鷹，唐克軒，等.大豆花粉管通道技術轉化雪花蓮凝集素（GNA）基因[J].分子植物育種，2006， 4（5）：661-667.

[15] 盧占軍，陳眷華，劉敏躍.轉基因技術及其應用[J].飼料工業，2005，25（12）：58-63.

[16] 馬盾，黃樂平，黃全生，等.花粉管通道法在棉花轉基因上的應用[J].新疆農業科學，2004，41（1）：29-30.

[17] 馬玲玲，魏延宏，何蘭蘭，等.基因槍介導的海島棉（Gossypium barbadense L.）莖尖遺傳轉化體系的建立[J].棉花學報，2014，26（3）：213-220.

[18] 孟昭河，劉新軍，王玉菊，等.利用花粉管通道法將外源DNA導入水稻之研究進展[J].中國農學通報，2006（6）：52-56.

[19] 邱新棉，俞碧霞，朱乾浩，等.天然彩色棉育種初報[J].中國棉花，2000，27（1）：24-25.

[20] 劉傳亮，武芝霞，張朝軍，等.農桿菌介導棉花大規模高效轉化體系的研究[J].西北植物學報，2004（5）：768-775.

[21] 陳妹幼，聶以春，張獻龍.轉化棉花胚性愈傷可以有效縮短轉基因周期[J].華中農業大學學報，2002（5）：406-408.

[22] 焦改麗，李俊峰，李燕娥，等.利用新的外植體建立棉花高效轉化系統的研究[J].棉花學報，2002（1）：22-27.

[23] 趙福永.棉花莖尖培養及高效植株再生體系的建立[J].長江大學學報，2008，5（4）：74-77.

[24] 朱華國，張獻龍，金雙俠，等.兩種常用激素組合下棉花體細胞胚胎發生過程的組織學觀察[J].棉花學報，2012（2）：159-166.

[25] 王靜，聶祥祥，李冠.農桿菌介導轉化新疆棉花體系的優化[J].新疆大學學報（自然科學版），2013，30（2）：218-223.

[26] Satyavathi V V， Prasad V， Gita Lakshmi B. High efficiency transformation protocol for three Indian cotton varieties via Agrobacterium tumefaciens[J]. Plant science， 2002， 162（2）： 215-223.

[27] 劉明月，左開井.農桿菌介導棉花莖尖遺傳轉化體系優化[J].上海交通大學學報（農業科學版），2011，29（2）：25-31.

[28] 李艷軍.彩色棉纖維比較蛋白質組學研究及花色素還原酶GhANR基因的鑒定[D].石河子：石河子大學，2013.

[29] Smith R， Price H J， Thaxton J R. Defined conditions for the initiation and growth of cotton callus in vitro I. Gossypium arboretum[J]. In vitro Cell Dell Biol， 1977（13）：329-334.

[30] Abeles F B， Bosshart R P， Forrence L E. Preparation and purification of glucanase and chitinase from bean leaves[J]. Plant Physiology， 1971，47：129-134.

[31] 解曉紅，張換樣，李靜，等.農桿菌介導陸地棉轉化和再生體系的研究進展[J].棉花學報，2011，23（4）：379-384.

[32] 周麗容，陳全家，賀雅婷，等.農桿菌介導海島棉胚性愈傷高效遺傳轉化體系的研究[J].新疆農業大學學報，2011，34（4）：317-320.

[33] 孫旭，蘇翔，凌磊，蔡沂，等.農桿菌介導莖尖轉化體系對不同基因型棉花轉化率的影響[J].中國農學通報，2009，25（7）：62-66.

[34] 任永霞，季靜，王罡，等.植物遺傳轉化方法概述[J].河北北方學院學報（自然科學版），2005（6）：38-42 .

[35] 侍福梅.農桿菌介導的彩色棉花遺傳轉化影響因素研究[D].雅安：四川農業大學，2004.

[36] 劉衛民，李瓊.農桿菌介導棉花遺傳轉化影響因素的研究[J].農業科技通訊，2014（12）：94-97.

[37] 趙福永.棉花莖尖農桿菌轉化體系的建立[J].安徽農業科學，2009，37（2）：515- 518.

[38] 陳天子.基于組織培養和授粉后浸蘸花柱的兩種棉花遺傳轉化體系的建立[D].南京：南京農業大學，2009.

[39] 鄭泗軍.季道藩.許復華.光質和凝固劑對陸地棉愈傷組織誘導和生長的影響[J].中國棉花，1995（5）：8-9.

（責任編輯：易? 婧）