精氨酸代琥珀酸合成酶1在肝細胞癌進展中的作用和潛在價值

羅 霞，史青苗，余祖江

鄭州大學第一附屬醫院感染性疾病科，河南 鄭州 450052

原發性肝癌是世界范圍內第六大常見癌癥，也是第四大癌癥相關死亡原因，每年新增病例約84.1萬例，年死亡病例約78.2萬人[1]，而我國原發性肝癌患者的人數約占全球的一半[2]。肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)占原發性肝癌的75%～85%。手術切除是早期HCC治療的首選方法及主要治療方式，但多數患者在就診時已經發生肝內和肝外轉移，失去手術治療機會。只有不到30%的患者適合采用手術切除、肝移植、動脈栓塞等治療方案[3-4]。而目前獲得批準的治療HCC的一線分子靶向藥物索拉非尼和侖伐替尼、二線藥物瑞戈非尼以及免疫檢查點抑制劑等雖為HCC患者帶來了福音，但因不良反應大以及耐藥問題等存在很多局限性[5-7]。因此，探討HCC的發生、發展及其轉移復發的分子機制，尋找潛在的特異性分子生物靶點對于HCC診斷治療有著極其重要的意義。

尿素循環是將劇毒氨轉化為尿素排出體外的氨解毒代謝途徑[8-9]。通過同位素標記相對和絕對定量(isobaric tags for relative and absolute quantification,iTRAQ)技術以及Western blotting等技術對大血管侵犯肝癌患者的腫瘤組織及臨近正常組織進行蛋白組學定量差異分析顯示，尿素循環中的5種關鍵酶氨基甲酰磷酸合成酶1(carbamoyl phosphate synthetase 1，CPS-1)、鳥氨酸氨基甲酰轉移酶(ornithine carbamoyl transferase，OCT)、精氨酸代琥珀酸合成酶1(argininosuccinate synthetase 1，ASS1)、精氨酸代琥珀酸裂解酶(argininosuccinate lyase，ASL)、精氨酸酶(arginase)在HCC組織中均異常下調，而尿素循環中關鍵酶的異常下調可通過促進HCC大血管的侵襲和轉移而降低HCC患者的總體生存期[10]。其中，ASS1可催化天冬氨酸和瓜氨酸轉化為精氨酸代琥珀酸，后在ASL的作用下裂解生成精氨酸。精氨酸是一種半必需氨基酸，是合成多種影響癌細胞生長、增殖、侵襲、免疫和轉移的代謝物的底物。HCC患者由于ASS1低表達或表達缺失不能從頭合成精氨酸，極度依賴外源性精氨酸維持必要的生物學過程，因此，HCC呈現出明顯的精氨酸依賴現象。最近的研究證明，ASS1的過表達可明顯抑制肝癌細胞的體外轉移潛能和體內肺轉移率，相反，敲除ASS1可顯著提高體內外肝癌細胞的侵襲能力[11]。本文結合該領域的最新研究進展，從ASS1的生化結構、功能調節及其在HCC進展中的作用和潛在價值，以期為HCC的精準治療提供新的特異性分子治療靶點及新的治療策略提供理論依據。

1 ASS1的生化結構及功能調節

ASS1是哺乳動物體內普遍存在的酶，主要在腎臟和肝臟門脈周圍肝細胞和內皮細胞中表達，其表達水平因細胞的種類、分化程度和作用而異。ASS1也是一種高度保守的肝細胞胞漿酶，主要參與精氨酸的合成代謝。人類ASS1蛋白的生化結構主要由三部分組成，分別為核苷酸結合域、合成酶帶和多聚螺旋C端，構成同源四聚體結構。ASS1基因位于人類第9號染色體上即9q34.11～9q34.12，有16個外顯子和1 236個堿基對組成的開放閱讀框。在ASS1的第1個內含子和啟動子中有大量富含CpG的區域，通常不受甲基化保護的區域被稱為“CpG島”，在腫瘤發生過程中易發生高甲基化。在進行甲基化特異性PCR檢測及甲基化測序時顯示，肝癌組織中ASS1的甲基化水平明顯高于正常肝組織和癌旁組織，同時存在很多從C到T的突變。肝癌組織中ASS1缺失的機制可能是DNA編碼ASS1的甲基化所致，也導致了腫瘤對外源性精氨酸的依賴[12]。DNA甲基化模式的異常破壞與癌變發生有關，可能導致基因沉默和惡性細胞轉化[13]。因此，通過利用甲基化抑制劑5-氮雜胞苷(5’AZA)逆轉甲基化狀態，使細胞重新表達ASS1。

ASS1表達的調控是復雜的、動態的。肝臟中的ASS基因高度表達，其中細胞外激素、營養物質如氨基酸、細胞因子和轉錄因子等主要在轉錄水平上調節ASS1基因表達，如(1)糖皮質激素、胰高血糖素和胰島素，特別是在發育和成年期控制該基因的表達；(2)飲食蛋白攝入刺激ASS基因的表達，對谷氨酰胺等特定氨基酸具有特異性；(3)轉錄誘導因子，ASS1的基因表達是由結合在ASS1近端啟動子上E-box的正性轉錄因子c-Myc與Sp4和負性轉錄因子HIF-1α交互作用調控的。(4)ASS1在缺氧和酸性狀態下的表達下調，ASS1在腫瘤中的表達下調可能導致上游代謝物如谷氨酰胺和氨(來源于谷氨酰胺)的積累，這些代謝產物可以堿化腫瘤細胞內的pH，維持腫瘤細胞膜兩側pH的梯度，對腫瘤細胞的存活、侵襲和遷移至關重要，從而為腫瘤細胞提供了氧化還原和pH值的優勢，提高了其存活率[14]。

2 ASS1在腫瘤中的作用

腫瘤細胞中尿素循環酶的表達下調導致了腫瘤中普遍存在尿素循環障礙，隨后激活了CAD復合酶體(包括氨基甲酰磷酸合成酶Ⅱ、天門冬氨酸氨基甲酰轉移酶和二氫乳清酸酶)的活性使氮源流傾向于嘧啶的合成，使細胞核中嘧啶與嘌呤的不平衡，增加了嘌呤突變為嘧啶的風險，這與腫瘤的發生密切相關[9]。CAD復合酶體是指位于同一條肽鏈的一種多功能復合酶，有利于以均勻的速度參與嘧啶核苷酸的合成。胞漿中的天冬氨酸不僅作為ASS1的底物提供氨基，同時也是CAD復合酶體的底物。在ASS1缺乏或低表達的腫瘤細胞中，胞漿中的天冬氨酸異常積累，導致CAD異?；罨?，同時增加了底物的可用性,促進了CAD催化嘧啶核苷酸的合成，為腫瘤細胞的增殖提供了原料[15]。因此，對于ASS1表達缺陷或低表達的腫瘤，尤其是那些對精氨酸降解酶產生耐藥性的腫瘤，可將天冬氨酸剝奪作為一種額外的治療干預策略。

隨著對ASS1在腫瘤發生和發展中作用的研究不斷深入，越來越多的證據表明，ASS1與腫瘤的增殖、侵襲、轉移和預后密切相關。ASS1的低表達與骨肉瘤患者術后肺轉移和不良臨床結局顯著相關，臨床前試驗中ASS1的過表達在體外抑制了腫瘤生長，因此，ASS1可能為骨肉瘤患者轉移和不良反應的預測生物標志物[16]；另外，ASS1作為黏液纖維肉瘤的抑癌基因，具有抗血管生成、抗增殖、抗氧化及抗侵襲的特性，與黏液纖維肉瘤的分級和分期的增加密切相關，并且可以獨立的預測腫瘤的無轉移生存期和疾病特異性生存期[17]。與這些結果一致，約51.6%(64/124)的鼻咽癌患者存在ASS1表達缺失，與晚期鼻咽癌分期、DNA甲基化和臨床侵襲性相關，ASS1的表觀失活與顯著降低的總體生存期和無轉移生存期相關，也表明該ASS1具有腫瘤抑制功能[18]。

然而，值得我們關注的是在不同類型的腫瘤中，ASS1在臨床結果中的作用可能不同。已有研究表明，ASS1在胃癌中呈高表達，并與胃癌侵襲性及預后不良呈正相關[19]。另外，ASS1在結直腸腫瘤中也呈高表達，可以作為人類原發性結直腸腫瘤的上調靶點，應用ASS1抑制劑或敲除ASS1時會削弱結直腸腫瘤的致病性[20]。腫瘤細胞中ASS1的基礎表達差異可能導致相反的臨床結果。ASS1在腫瘤中的雙重作用機制尚不清楚，因此，需要進一步深入研究，以探索其潛在機制。

3 目前ASS1在HCC進展中的作用機制的研究進展

腫瘤轉移是癌細胞進入血管系統向遠處器官轉移和侵襲的復雜過程，是各種癌癥發病和死亡的主要原因。HCC轉移定義為經門靜脈播散的肝內轉移，或肝外轉移到其他器官，包括肺、淋巴結、骨骼和腎上腺。肝內和肝外轉移發生在半數以上的HCC切除患者中，肝內轉移更為常見。腫瘤轉移是一個復雜的多步驟過程，包括原發腫瘤細胞的擴散和血管內灌注，循環腫瘤細胞的存活，新的微小轉移瘤的形成，以及隨后這些腫瘤細胞向臨床可檢測到的轉移病灶的增殖，是由復雜的細胞內和細胞間信號傳導網絡級聯調控的，因此，腫瘤轉移仍是腫瘤進展機制中最不為人知的部分[21]。肝癌細胞的血管侵犯、轉移和復發導致了患者的預后不良。HCC的侵襲轉移發生機制復雜，多種信號通路參與其中。其中，上皮-間質轉化(epithlial mesenchymal transition,EMT)是腫瘤侵襲過程中的關鍵事件，上皮細胞層失去極性和細胞間的相互作用導致細胞骨架重塑[22]。腫瘤細胞分泌的基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是一類鋅依賴性內源性蛋白酶，通過降解基底膜啟動血管生成[23]。這改變了細胞與細胞之間的相互作用，促進了內皮細胞通過所形成的間隙向腫瘤細胞的聚集遷移，導致新血管的增殖和形成[24]。

在研究人類磷酸激酶陣列探索ASS1調控的蛋白磷酸化參與HCC的轉移時，發現pSTAT3Ser727是ASS1調控的最特異的下游激酶。當敲除ASS1時，pSTAT3Ser727水平升高；當ASS1過表達時，pSTAT3Ser727水平下降，證明了STAT3蛋白表達與ASS1的表達有關。在HCC中，STAT3的缺失可能會顯著損害通過下調ASS1而增加的轉移能力，表明ASS1通過STAT3調節HCC的侵襲[11]。信號傳導與轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)因含有SH2和SH3結構域，故可與特定的含磷酸化酪氨酸的肽段結合。在絲氨酸蛋白激酶的作用下，位于絲氨酸(Serine,Ser)727位點的STAT3被磷酸化后形成pSTAT3Ser727，pSTAT3Ser727蛋白有三個方面作用：(1)可發生聚合成為同源或異源二聚體形式的活化轉錄激活因子，進入胞核內與靶基因啟動子序列的特定位點結合，促進其轉錄；(2)pSTAT3Ser727蛋白可誘導血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)生成，促進血管生成；(3)激活MMPs等轉移相關蛋白的表達，MMPs通過激活生長因子、抑制細胞凋亡、誘導血管生成、增強組織再生等多種途徑促進腫瘤進展[25]。其中，MMP-9是STAT3通路激活后產生的下游蛋白因子，幾乎能夠降解基質中的各種蛋白質成分，破壞腫瘤細胞侵襲的組織學屏障，在腫瘤侵襲轉移過程中起關鍵性作用。

在進行全人類基因組微陣列分析時，發現STAT3信號通路中識別ASS1調控的差異基因的合適靶點是分化抑制蛋白-1(ID1)[11]。ID1又稱DNA結合抑制因子，是一種螺旋—環—螺旋(HLH)結構的負性轉錄因子調控蛋白，這類蛋白不具有與特定DNA結合的能力，可與堿性HLH家族成員形成異二聚體，抑制轉錄因子的DNA結合和轉錄激活能力。ID1在人和小鼠肝臟腫瘤及HCC細胞系中均有較高表達，可通過MAPK/ERK通路在轉錄水平上調控ID1的表達。敲除ID1基因抑制了好氧糖酵解和谷氨酰胺分解，使代謝向有氧糖酵解方向轉變，促進了HCC細胞的代謝重新編程[26]。而在敲除ASS1時，HCC細胞中的ID1水平升高；當ASS1過表達時，ID1水平下降[11]。而STAT3是ID1表達的又一重要調控因子[27]，pSTAT3Ser727在HCC患者中表達與ID1呈正相關。因此，ASS1過表達可能通過抑制pSTAT3Ser727通路負向調控ID1表達,從而抑制HCC進展[11]。但ASS1調控HCC進展的具體分子機制仍需繼續探討。

4 ASS1在HCC進展中的潛在價值

大血管浸潤(macrovascular infiltration,MVI)是HCC患者預后差的因素之一。MVI主要是指腫瘤侵犯門靜脈或肝靜脈主干或分支[28]。利用iTRAQ等技術對大血管侵犯HCC患者的腫瘤組織及鄰近正常組織進行蛋白組學定量差異分析顯示，尿素循環中的五種關鍵酶(CPS1、OTC、ASS1、ASL、ARG1)在大血管侵犯的HCC組織中均呈異常下調，尿素循環失調通過促進HCC大血管的侵襲和轉移抑制HCC總生存率。尤其是尿素循環中的關鍵酶失調可能成為進一步研究大血管侵犯HCC患者的潛在治療靶點[10]。在使用比較蛋白組學研究HCC患者轉移復發的生物標志物時，發現三種生物標志物(HSP70、ASS1、UGP2)聯合應用對HCC轉移復發的預測比單獨甲胎蛋白(AFP)具有更高的靈敏性和特異性，轉移性復發性HCC組中ASS1的表達明顯低于非復發性HCC組，亦表明ASS1可作為轉移性復發性HCC的預測生物標志物[29]。最新的研究表明，ASS1的穩定沉默促進了HCC細胞的遷移和侵襲，而過表達則抑制了HCC細胞在體內和體外的轉移[11]。

5 ASS1與HCC的治療

HCC由于ASS1低表達或表達缺陷失去獨立合成精氨酸的能力，只能利用細胞外精氨酸維持其生長代謝需要，因此，可通過剝奪細胞外精氨酸靶向殺傷這類腫瘤。癌癥模型的臨床前研究已經證明了精氨酸剝奪會導致線粒體功能障礙、活性氧積累、DNA和染色質損傷，最終導致癌細胞死亡[30]。精氨酸脫氨酶是催化精氨酸轉化為瓜氨酸的酶，經聚乙二醇修飾的聚乙二醇化精氨酸脫亞胺酶(ADI-PEG 20)抗原性減弱、半衰期延長。之前的研究[31]證實了ADI-PEG 20在肝癌患者的Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗中取得了顯著進展，但最近的ADI-PEG 20應用于既往治療失敗的晚期肝癌患者中的Ⅲ期隨機對照臨床試驗結果顯示，ADI-PEG 20單一療法未顯示出中位生存期的益處，但具有很好的耐受性，目前旨在延長精氨酸耗竭時間和協同ADI-PEG 20效應的策略臨床試驗正在進行中[32]。

前文已經闡述了尿素循環障礙導致的嘧啶合成增加不僅會促進腫瘤增殖也會由于嘧啶與嘌呤比例失調而引起DNA、RNA甚至是蛋白水平的突變，使腫瘤細胞對免疫療法更敏感[9]，同時，使用ADI-PEG20治療對正常細胞影響并不明顯，因此，ADI-PEG20可以嘗試與化療或免疫療法聯合使用治療HCC。近來的研究數據也已證實了ADI-PEG20與5-氟尿嘧啶(5-FU)的聯合治療比單一治療更能導致ASS1陰性的肝癌細胞死亡[33]。另外，ADI-PEG 20和改良的FOLFOX6(mFOLFOX6)聯合治療難治性HCC和其他進展期胃腸道腫瘤的Ⅰ期臨床試驗顯示出令人鼓舞的初步療效，且是安全的、可耐受的,目前的Ⅱ期多中心的臨床研究亦正在進行中[34]。

6 未來展望

本文聚焦尿素循環關鍵限速酶ASS1在HCC中的進行情況，分析HCC患者中ASS1的異常表達對HCC惡性表型的調控機制及其在HCC進展中的作用和潛在價值，通過靶向腫瘤細胞的異常代謝為HCC臨床的精準治療提供新靶點及理論支持。但由于目前對ASS1如何具體調控HCC進展的分子機制尚不清楚，未來需結合基礎生物學研究和大型臨床試驗進一步探討ASS1調控HCC進展的具體分子機制。