水稻全基因組測序揭示的粳稻與秈稻亞種內品種間多態性研究

陳喜娜，袁澤科，杜彥修，李俊周，張靜，彭廷，趙全志，孫紅正

(河南農業大學農學院，河南 鄭州 450046)

圖位克隆是迄今為止最為有效的克隆水稻未知基因的方法，水稻大多重要農藝性狀基因都是通過圖位克隆獲得的[1-5]。秈稻和粳稻來自普通野生稻祖先，由于生殖隔離，秈稻與粳稻之間雜交不育或低育性一直是亞種間雜交的主要障礙[6-7]。另外，秈稻和粳稻間遺傳背景差異較大導致的后代群體偏分離等現象也對目標表型鑒定造成較大的影響[8-9]。相對于亞種間雜交，亞種內雜交則不存在雜交不育或偏分離的情況，因此，亞種內雜交相對于亞種間雜交的優勢不言而喻。得到足夠多的多態性標記是基因圖位克隆的首要條件，由于亞種間的多態性高于亞種內的多態性[10-11]，因此，在大多數圖位克隆研究中，為了得到足夠多的多態性分子標記，分離群體的構建都是采用秈稻和粳稻亞種間雜交的方式構建的。隨著DNA測序技術的發展，全基因組測序越來越普遍，從而極大地促進了正向遺傳學的發展。在2014年, 超過3 000份水稻種質資源被測序，并發現了超過2 000萬個SNP(Single nucleotide polymorphism)位點[12-13]。隨后的分析在3 010份種質資源測序數據中鑒定出2 900萬個SNP位點、240萬個InDel(Insertion/Deletion)和9萬個基因組結構變異[14]。為了研究全基因組范圍內亞種內和亞種間的多態性水平，本研究從水稻3K測序項目中選取了32份種質資源，分別包含了秈稻和粳稻的5種主要類型，以評價亞種內的多態性水平及其在染色體上的密度分布。

1 材料與方法

1.1 材料

32份水稻種質資源，選自3 000份水稻基因組重測序項目，包括16份秈稻和16份粳稻種質資源(表1)。其中粳稻種質資源包括4份中間類型、4份粳稻類型、4份溫帶粳稻類型和4份熱帶粳稻類型。所有種質資源的測序深度均在10倍以上。

1.2 方法

基因組測序數據下載自3KRG SNP & indel datasets release 1.0(http://oryzasnp.org/)。對亞種間和亞種內種質資源兩兩之間的SNP和InDel數量進行統計。使用MEGA軟件對32份種質資源的SNP序列數據采用Neighbour-joining方法構建系統進化樹，進化樹的可靠性通過1 000次的Bootstrap進行驗證。亞種內與亞種間的遺傳距離使用MEGA軟件中的最大復合似然方法進行計算。SNP/InDel在染色體上的密度圖使用R軟件包CMplot(https://github.com/YinLiLin/R-CMplot)進行繪制。

表1 本研究所用水稻種質資源列表

續表1

2 結果與分析

2.1 32份水稻種質資源的親緣關系分析

為確定所選用水稻種質資源的親緣關系，使用32份水稻種質資源的SNP構建系統進化樹。不同種質資源的測序深度不同(表1)，雖然在32份水稻種質資源中共檢測到5 280 807個SNP，但是，其中有些SNP并未在所有種質資源中被檢測到，因此，經過篩選共有在所有32份種質資源都被檢測的913 117個SNP被用于構建系統進化樹。系統進化樹顯示32份水稻種質資源可以很好地被分成秈稻和粳稻兩大支(圖1)。其中，秈稻種質資源可以很好地聚成1支，粳稻種質資源中有4份熱帶種質形成1個小分支，其他溫帶種質、中間類型和其他類型的粳稻沒有聚成單一的小分支。4份中間類型的種質資源中，粳7623(B141)和霸王鞭1(B084)位于秈稻和粳稻分支中間，但更傾向于粳稻分支。另外2份中間類型種質資源粳87-304(B124)和越光(CX330)則混于粳稻分支中，因此，在后續分析中，4份中間類型的種質資源被劃分到粳稻分支中分析。

2.2 32份水稻亞種間和亞種內的SNP和InDel差異分析

在32份水稻種質資源中共發現5 280 807個多態性SNP位點和478 996個InDel位點，對每份種質資源兩兩之間的差異SNP和InDel數量進行統計發現，亞種間種質資源兩兩之間的SNP數量平均值為1 744 498個，InDel數量平均值為159 829個(圖2)。

在所選用的32份種質資源中，亞種間兩兩種質資源多態性InDel數最少的是粵香占和粳7623(CX17-B141)，兩者之間有112 101個InDel。而InDel數量最多的是魔王谷內雜和山酒谷(B095～B245)，全基因組范圍內共檢測到196 854個InDel。亞種間多態性SNP數量最多的組合是魔王谷內雜和徐稻4號(B095～CX251)，共有2 220 309個SNP，而SNP數量最少的組合是湘矮早10號和粳7623(B232～B141)，共有919 316個SNP(圖3)。

秈稻亞種內種質資源之間平均有108 850 InDels和650 797 SNP，竹珍B和G珍汕97B(B248～B156)之間的InDel和SNP在所有秈稻組合中最少，分別為59 773和9 092。湘矮早10號與油黏(B232～B224)之間的InDel數量最多，InDel達到130 094個。明恢63與油黏之間SNP數量最多(CX145～B224)，有934 526個SNP(圖3)。

粳稻亞種內種質資源兩兩之間平均有57 384個InDel和639 927個SNP，在所有粳稻兩兩組合之間，粳87-304和越光(B124～CX330)之間的InDel和SNP數量最少， SNP有153 109個，InDel有16 298個。霸王鞭1和拉木加(B084～B241)之間的InDel數量最多，有103 825個InDel。粳7623和拉木加(B141～B241)之間的SNP數量最多，有1 309 253個SNP(圖3)。

遺傳距離反映種質資源間親緣關系與InDel和SNP多態性相一致，均表現為亞種間遺傳距離較遠，秈稻亞種內遺傳距離次之，粳稻亞種內遺傳距離較近(表2)。在粳稻的4個小類群內，類群內遺傳距離最大的是Japonica類型的種質，中間類型的種質資源類群內遺傳距離最小，而類群間遺傳距離均大于類群內遺傳距離。因此，在選取亞種內種質資源構建分離群體時，宜選用粳稻不同類群的種質以獲得更多的多態性標記位點。

圖1 32份水稻種質資源的親緣關系樹

2.3 秈稻與粳稻種質資源間SNP與InDel在染色體上的分布

為了研究粳稻與秈稻多態性SNP和InDel位點在染色體上的分布，對粳稻品種徐稻4號(CX251)和其他粳稻種質資源之間的SNP/InDel在染色體上的密度進行作圖。徐稻4號與其他粳稻種質資源兩兩之間的InDel數目為19 833～77 765個，SNP數目有185 943～1 182 934個。在粳稻亞種內同一類型的種質資源之間SNP/InDel的密度分布圖上可以看出，染色體上有較多的區域無多態性位點，而同亞種內不同類型種質資源之間的SNP/InDel位點則幾乎覆蓋全基因組。徐稻4號與越光均是現代粳稻品種，兩者之間的多態性SNP/InDel位點中，約90%的多態性位點之間的物理距離在1 000 bp之內，最長的多態位點之間距離約1.4 Mb(圖4-A)。而徐稻4號與熱帶類型粳稻種質資源毫馬克(K)之間的多態性位點幾乎覆蓋了整個基因組，無明顯的空白間隔區(圖4-B)。

秈稻亞種內的G珍汕97B與其他秈稻種質資源的SNP/InDel位點在染色體上的分布均無明顯的空白間隔區。亞種內兩兩種質資源之間多態性位點密度最低的是G珍汕97B和竹珍B組合(B156～B248)(圖4-C)，G珍汕97B與現代秈稻品種明恢63之間的多態性位點密度同樣處于較密的水平(圖4-D)。

注：A為InDel數量；B為SNP數量。

注：上三角顯示兩兩之間的SNP數量；下三角顯示兩兩之間的InDel數量。

表2 秈稻和粳稻類群內和類群間的遺傳距離

注：A：徐稻4號-越光；B：徐稻4號-毫馬克(K)；C：G珍汕97B-竹珍B；D：G珍汕97B-明恢63。

3 結論與討論

獲得親本間有多態性的分子標記是基因圖位克隆的必備先決條件，自從1988年使用RFLP構建第1張水稻分子標記遺傳圖譜以來，分子標記的應用不斷增多[15]。隨著分子標記技術發展，操作煩瑣的RFLP標記技術逐漸被其他基于PCR的檢測技術所取代，其中最具代表性的是SSR/InDel標記檢測技術。隨著秈稻和粳稻亞種的基因組序列完成測序，水稻SSR/InDel標記得到了極大豐富[16]?；赑CR的檢測技術方便易用性，這種分子標記方法至今仍被廣泛應用。隨后，新一代的SNP標記方法的出現使SNP成為遺傳學研究的有力工具，SNP標記在基因組內極為豐富，可以通過DNA測序、DNA芯片和KASP等技術進行檢測[17-20]。

雖然傳統的基因圖位克隆方法工作量極大且非常耗時，但卻是揭示未知重要基因最為有效的方法[21-22]。隨著QTL-Seq方法的報道，通過高通量測序技術發現新基因的進程得以極大加快[23]，這種QTL-Seq定位克隆基因的方法在模式物種水稻、玉米和擬南芥中得到廣泛應用[24-27]。WAMBUGU等[28]利用非洲稻和亞洲稻的分離群體通過QTL-seq方法定位了與淀粉含量相關位于GBSSI基因的SNP位點。ARIKIT等[29]也通過該方法定位了多個與米飯延伸率、淀粉含量、糊化溫度等多個QTL位點。LAHARI等[30]則通過QTL-seq方法利用F2分離群體定位了位于水稻第11染色體的水稻根結線蟲病抗性QTL位點，KAMOLSUKYEUNYONG等[31]也利用該方法定位了水稻灰飛虱的抗性QTL位點。與傳統圖位克隆方法相比，QTL-Seq方法無需進行大量的前期引物開發和群體檢測，只需要對分離群體中的極端個體混池進行測序即可對QTL位點定位。近幾年來采用這種方法有大量水稻基因被克隆[32]。QTL-Seq方法另外一個較大的優勢在于測序數據中可以發現大量的SNP位點，這些SNP位點在之前的傳統基因定位研究中是無法高效利用的，而SNP位點在基因組中又極為豐富，即使之前被認為多態性位點較少的親緣關系較近的種內種質資源之間也存在豐富的SNP差異位點，這些SNP差異位點都可以被用于基因定位研究。除了測序方法鑒定SNP差異位點，新的基于PCR方法也被開發出來用于SNP檢測，如競爭性等位基因特異性PCR技術(KASP，Kompetitive allele-specific PCR)[33-34]。

水稻基因圖位克隆研究中，使用秈稻和粳稻亞種間雜交構建分離群體是比較常見的做法，之所以選擇亞種間雜交其目的就是為了更方便地篩選具有多態性的引物。從水稻全基因組重測序項目中發現，水稻亞種內的多態性也是非常豐富的。在本研究所選用的32份種質資源中，秈稻兩兩之間的多態性標記密度達到每Mb 280～2 614個SNP/InDel，粳稻兩兩之間的標記密度達到每Mb 520～3 201個SNP/InDel，這樣的標記密度對基因克隆來說足夠豐富。一般認為粳稻的多態性低于秈稻，但是在本研究中溫帶類型的粳稻類群與中間類型粳稻類群的多態性要高于秈稻亞種內多態性。因此，在基因圖位克隆時，使用亞種內種質資源進行雜交構建分離群體也可能會得到足夠豐富的分子標記，同時又可克服秈粳雜交帶來的不利影響。在選擇材料時，應盡量選用亞種內不同類型的種質資源材料以增加多態性位點。