藜麥花期水分脅迫下的代謝組學分析

時羽杰，鄔曉勇，唐媛，糜加軒，萬雪琴

(1.四川農業大學林學院，四川 成都 611130； 2.成都大學農業農村部雜糧加工重點實驗室，四川 成都 610106； 3.成都大學藥學與生物工程學院，四川 成都 610106)

藜麥(Chenopodiumquinoa)是莧科藜亞科藜屬的1 a生雙子葉草本植物，是喜冷的高海拔作物，富含蛋白質、礦物質、氨基酸、纖維素、維生素等營養成分[1-2]。聯合國糧農組織(FAO)認為藜麥是唯一一種單體植物即可以滿足人體基本營養需求的食物，并正式推薦為最適宜人類的“全營養食品”[3]。其生物產量高、營養價值豐富、適應性強，具有耐寒、耐旱、耐瘠薄、耐鹽堿等特性[4-6]，常被用于糧食和飼料作物的開發利用，也成了一些地區發展經濟的重要作物[7-8]。

農作物在生長過程中常受到多種環境脅迫的影響[9]，造成生長發育不良，甚至絕收。水分脅迫是影響作物生產力的重要因素之一，也是影響作物生長和發育的一個重要環境因子，主要包括了水澇和干旱2種形式[10-11]。研究發現，作物開花期間，組織幼嫩，抗性較弱，易受到環境因子的脅迫，導致產量和品質降低[12-14]。藜麥起源于南美洲安第斯山脈高原地區[15]，進化出了較好的抗逆性能力。研究這種抗逆性機制，對植物栽培指導及抗性品種的選育有重要意義。目前，對藜麥的抗逆性機制研究，主要集中在鹽脅迫后生理指標的變化[16-18]、形態特征變化[19-21]、轉錄組分子機制研究[22-23]，干旱脅迫研究較少，也只局限于生理指標和形態特征的變化[24-27]，而有關藜麥水澇脅迫的研究更是微乎其微。

代謝組學(Metabolomics)是繼基因組、轉錄組和蛋白質組學后興起的一個系統生物學科[28]。通過對存在于生物體細胞、組織和生物流體中的小分子代謝物(相對分子質量小于1 000)進行系統分析[29]，從中檢測并篩選出具有顯著差異的代謝物質，并以此為基礎研究生物體的代謝過程和變化機制[30]。常被用于藥物鑒定和治療機制的研究[31-33]，植物的抗逆性研究[34-36]，家系圖譜分析[37]等。

本研究利用代謝組學技術，以藜麥為材料，采用盆栽法研究水分脅迫后其生理生態變化及代謝物質差異，了解水分脅迫下的主要代謝通路，為藜麥的抗水分脅迫機制及代謝調控機制奠定基礎，同時，也為制定花期水分栽培的科學管理制度提供理論指導，為藜麥的引種推廣提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗選用的材料“隴藜3號”由成都大學農業農村部雜糧加工重點實驗室和國家雜糧加工技術研發分中心提供。種子純凈度和發芽率均符合播種質量要求。

藜麥種子用質量分數為0.1%～0.15%的高錳酸鉀溶液浸泡20 min，以利消毒。營養土和自然土按同等比例進行混合后使用，選取子粒飽滿、大小均勻、無機械損傷、無病蟲害的成熟藜麥種子，均勻播撒于直徑為20 cm的塑料花盆中，澆適量的水，再用1～2 cm厚的營養土覆蓋。待幼苗長出第4片真葉后進行間苗，留下長勢相同的幼苗且保持合適的株間距[38]。由于藜麥抗旱性較強，不需要進行頻繁澆水。待苗長至第8片真葉時，再進行一次間苗，每盆定苗4株。

1.2 試驗方法

1.2.1 脅迫處理 初花期(顯穗后10 d)，取長勢一致的材料進行脅迫處理。對照組使用去離子水進行澆灌；干旱脅迫組使用質量分數為30%的PEG-6000進行澆灌處理[39]；水澇脅迫組使用雙套盆法進行淹水模擬[40]，將盆栽直接浸置水盆中澆灌至水浸沒花盆。在處理48 h后進行取樣，每個處理6盆重復，取從頂芽往下數的第3個節間處的葉片后立即用去離子水洗凈并用無菌濾紙吸干，包裹于錫箔紙中，迅速置于液氮冷凍后，于-80 ℃超低溫冰箱保存，用于生理指標和代謝組學分析。

1.2.2 生理指標測定 過氧化物酶(POD)活性、總抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)含量、可溶性糖(WSS)含量均采用南京建成生物工程研究所的試劑盒進行檢測；可溶性蛋白(SP)含量采用考馬斯亮藍法測定[41]。

1.2.3 代謝組學分析 取同一批材料進行代謝組學分析，6個生物重復，共產生了2組對比數據，分別為正常對照組(CK)和干旱脅迫組(WD)、正常對照組(CK)和水澇脅迫組(WW)。代謝物的分離鑒定平臺為氣相色譜串聯質譜GC-MS(PerkinElmer，USA)，分析時每6個樣本插入一個質控樣本(QC)以觀察儀器的重復性與穩定性。色譜柱為DB-5MS(Agilent，USA)。原始數據經MSDIAL軟件進行峰識別、匹配、對齊等處理[42]。處理后的數據采用SIMCA-P14.1軟件進行PCA，PLS-DA和OPLS-DA等多元統計分析和差異物質篩選。最后，將差異代謝物經過NIST，METLIN，MASSBANK等數據庫進行鑒定獲取CID號，根據CID號在Metaboanalyst平臺進行相關代謝通路的分析。

1.2.4 數據處理 生理指標數據采用SPSS 26.0進行描述統計、方差分析和LSD多重比較，顯著性差異的標準為P<0.05；代謝組學數據采用SIMCA-P和TBtools進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 水分脅迫對藜麥花期生理指標的影響

由表1可知，水分脅迫后SP含量降低，但與對照均無顯著差異；WSS含量顯著增加(P<0.05)，且干旱脅迫組增加幅度顯著大于水澇脅迫組；POD活性顯著增加(P<0.05)，但干旱脅迫組和水澇脅迫組間無明顯差異；T-AOC變化趨勢與WSS含量變化趨勢相同，均表現為顯著增加(P<0.05)，且干旱脅迫組增加幅度顯著大于水澇脅迫組；而MDA含量在受到水分脅迫后表現為增加的趨勢，但增加幅度有明顯的差異，其中干旱脅迫MDA含量組較對照組表現為顯著增加(P<0.05)，水澇脅迫組的MDA含量增加幅度則較小，與對照組無顯著差異。說明藜麥花期受到水分脅迫時，可通過提高滲透調節物質含量和抗氧化酶活性來響應脅迫，且在水澇脅迫下影響較小，而在干旱脅迫下影響較大，MDA含量較CK組顯著增加，可能是氧自由基積累過多，已對膜系統產生了嚴重損傷。

表1 水分脅迫對藜麥花期生理指標的影響

2.2 水分脅迫條件下藜麥花期的代謝組學分析

2.2.1 PCA與OPLS-DA分析 主成分分析(Principal component analysis，PCA)得到的PCA模型能全面地反映代謝組整體數據的原始狀態，可以用于異常樣本的發現與剔除，提高模型的準確性[43-44]。如圖1所示，所有樣本都在95%的置信區間內，且CK，WD,WW組間均有明顯的界限，說明各組間的整體代謝物質差異顯著；除了QC_1，WD_1，WD_2等3個樣本外，其余樣本組內較為聚集，說明數據重復性較好，可用于后續的分析。

雖然主成分分析法能夠有效地提取主要信息，但是對于相關性較小的變量不敏感，而正交-偏最小二乘判別分析(Orthogonal projections to latent structures discriminant analysis,OPLS-DA)能通過正交信號校正技術將數據集X分解為與Y相關和非相關的兩類，過濾掉與分類無關的信息，將相關的信息集中在第1個預測成分，更好地觀察組間的差異[45-46]。如圖2所示，CK和干旱脅迫與CK和水分脅迫都被分開且均勻地分布于PC 1左右兩側，說明藜麥花期受到水分脅迫后，代謝物質發生了顯著性變化。為了驗證OPLS-DA模型是否過擬合，進行置換檢驗，對模型進行n=200的排列驗證，其中R2和Q2表示擬合優度系數，當R2和Q2回歸線的斜率大于1，且置換檢驗圖中所有R2和Q2左邊的點都低于最右邊的點，這樣表示模型可靠[47-48]。如圖3所示，CK和干旱脅迫組的R2=0.996，Q2=0.266，CK和水分脅迫組的R2=0.755，Q2=0.416，且所有R2和Q2左邊的點都低于最右邊的點。說明這2組OPLS-DA模型可靠，可以用于差異代謝物質的篩選。

注：CK表示正常對照組；QC表示質控樣本；WD表示干旱脅迫； WW表示水澇脅迫。下同。

圖2 對比組的OPLS-DA模型得分圖

注：左圖為干旱脅迫組，右圖為水澇脅迫組；其中R2和Q2表示擬合優度系數，R2為模型對矩陣的解釋率，Q2為模型的預測能力。

2.2.2 差異代謝物的篩選 通過OPLS-DA的S-plot圖進行差異代謝物的篩選，其中橫坐標表示主成分與代謝物的協方差，縱坐標表示主成分與代謝物的相關系數，越靠近右上角和左下角的代謝物表示其差異越顯著，一般選取VIP≥1的物質作為差異代謝物。如圖4所示，VIP≥1的點已用紅色標出。結合火山圖(V-plot)能更加全面地反映差異數據的變化規律，更利于篩選差異代謝物[49]。篩選的標準為P≤0.05且VIP≥1，由圖5所示，CK和干旱脅迫組中總共篩選出60個差異代謝物，且代謝物主要以下調為主。其中有53個下調代謝物主要包括16個氨基酸類(色氨酸、脯氨酸、甘氨酸、谷氨酸、絲氨酸和蛋氨酸等)，6個有機酸類和4個脂肪酸類(甘油酸、十四烷酸、肉豆蔻酸等)，14個糖類及其衍生物(阿拉伯糖、木酮糖、果糖、乳糖等)和一些多酚、醇類、生物堿、維生素、胺類和核苷衍生物；7個上調代謝物分別是富馬酸、艾杜糖、尿苷、肌醇、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、N-乙酰-D-氨基葡萄糖和芥子酸。CK和水分脅迫組中總共篩選出74個差異代謝物，且代謝物主要以上調為主。其中，有57個上調代謝物主要包括13個氨基酸類(脯氨酸、丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸等)，12個有機酸類和3個脂肪酸類(十四烷酸、異檸檬酸、乳糖酸、肉豆蔻酸等)，17個糖類及其衍生物(阿洛糖、潘糖、麥芽糖、乳糖醇等)和一些多酚、生物堿、胺類和核苷衍生物；17個下調代謝物主要包括氨基酸類、糖類、有機酸類(色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、纖維二糖、蔗糖、甘露糖、原兒茶酸、十五烷酸等)。根據所包含差異代謝物數量的多少，發現氨基酸類、糖類、有機酸類和脂肪酸類是最活躍的4個類別。這些數量較多的差異代謝物可能與藜麥花期響應水分脅迫的機制密切相關。為進一步探究這些差異代謝物質響應脅迫的機制，對其參與的代謝通路進行分析。

注：左圖為干旱脅迫組，右圖為水澇脅迫組；每1個點代表1種代謝物質，其中綠點為VIP<1，紅點為VIP≥1的差異代謝物。

注：左圖為干旱脅迫組，右圖為水澇脅迫組；每1個點代表1種代謝物質，其中綠點僅為VIP≥1，紅點為VIP≥1且P<0.05的顯著差異代謝物。

2.2.3 差異代謝物聚類熱圖分析 聚類熱圖表現的是一個數據矩陣，可以通過不同顏色的梯度來顯示代謝物質差異，再通過聚類分組，將代謝表達模式相近的組歸為1類，同組的代謝物質可能具有相似的功能或參與了相同的代謝途徑，可以以此來推測未知代謝物或已知代謝的功能[50-51],如圖6所示。CK和干旱脅迫(WD)組中，樣本被分為3類：第1類是CK_5，CK_1，CK_4，CK_2，CK_3，CK_6；第2類是WD_1和WD_2；第3類是WD_3，WD_4，WD_5，WD_6。說明CK組內代謝物質差異不大，樣本重復性較好，數據較為穩定，而干旱脅迫組內有2個樣本單獨聚為1類，再與CK組聚為1類，可能是由于采樣不當引起的誤差，而其余4個聚為1類。說明干旱脅迫組整體數據重復性仍較好，篩選出的代謝物與CK組存在明顯差異，且大部分差異代謝物質表達下調。CK和水澇脅迫(WW)組中，樣本被分為2類，第1類是CK的6個重復樣本，第2類是水澇脅迫的6個重復樣本。這說明組內的重復性都較好，且篩選出的代謝物在組間存在明顯差異，水澇脅迫組中大部分代謝物質表達上調。這些篩選出的差異代謝物質可以用于后續的關鍵代謝通路分析。

注：圖中紅色的表示高表達代謝物，黑色的代表變化不大，綠色的表示低表達代謝物。列為不同的樣本組，行為不同的代謝物質。

2.2.4 代謝通路分析 通過Metaboanalyst平臺將有CID號的顯著差異代謝物進行KEGG通路富集分析,如圖7所示。CK和干旱脅迫組中注釋到46條代謝通路，極顯著的通路有4條，分別是氨酰-tRNA生物合成、二羧酸代謝、甘氨酸-絲氨酸和蘇氨酸代謝、吲哚生物堿合成，顯著的代謝通路有5條，分別是硫代謝、半胱氨酸與蛋氨酸代謝、精氨酸生物合成、丙氨酸-天冬氨酸和谷氨酸代謝、泛酸和輔酶A生物合成。其中，參與極顯著代謝通路且被檢測到的物質有13種，主要為氨基酸類及其衍生物和有機酸，分別是色氨酸、丙氨酸、纈氨酸、絲氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、脯氨酸、高絲氨酸、甘氨酸、組氨酸、色胺、甘油酸、異檸檬酸，且均為下調表達。CK和水澇脅迫組中注釋到47條代謝通路，極顯著的代謝通路有3條，分別是氨酰-tRNA生物合成、二羧酸代謝、吲哚生物堿合成，顯著的代謝通路有6條，分別是異喹啉生物堿合成、氰胺酸代謝、精氨酸生物合成、甘氨酸-絲氨酸和蘇氨酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、賴氨酸生物合成。其中，參與極顯著代謝通路且被檢測到的物質有14種，主要為氨基酸類及其衍生物和有機酸，10種上調代謝物，分別為異檸檬酸、甘氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、絲氨酸、異亮氨酸、組氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、色胺，4種下調代謝物，分別為天冬氨酸、谷氨酸、色氨酸、草酸。

注：左圖為干旱脅迫組，右圖為水澇脅迫組；每1個點代表1個代謝通路，其中點的大小表示富集代謝物質的多少。

3 結論與討論

3.1 水分脅迫對藜麥花期生理指標的影響

WSS含量、SP含量、POD活性、T-AOC和MDA含量是反映植物受脅迫的重要生理指標，可以判斷其對脅迫的耐受性[52-54]。其中MDA是植物細胞膜脂過氧化的主要產物，對植物有毒害作用，其含量的多少直接反映了植物在逆境脅迫下膜受損傷程度[55]。WSS和SP是植物細胞中的重要滲透調節物質，POD是重要的抗氧化酶之一，在植物受到脅迫時，體內的活性氧會積累，MDA含量增加，對植物體造成傷害，其體內的滲透調節物質和抗氧化酶能夠減緩膜脂過氧化的毒害作用[56]。藜麥花期受到干旱和水澇脅迫后，生理指標變化十分相似，除SP變化不大外，其他指標均呈明顯上升(水澇脅迫組的MDA含量稍增加)，干旱脅迫組的MDA含量增加的幅度較大。說明藜麥花期受到水分脅迫后，活性氧(ROS)過度積累損傷膜系統，蛋白質降解，自身通過調節活性氧系統來應對氧化損傷，如提高POD活性，同時提高WSS含量來減少細胞水分流失、維持細胞結構完整性。宿婧等[57]研究干旱脅迫對藜麥種子生理特性的影響，發現POD活性在干旱脅迫下顯著增加，且隨著PEG-6000質量濃度的增加而增加。董奇琦等[58]研究發現,花生在重度干旱脅迫下POD,SOD,MDA,WSS,Pro顯著增加，SP含量呈下降趨勢。此外，本試驗中,干旱脅迫組的MDA含量顯著增加，且增加幅度遠大于水澇脅迫組，可能是由于藜麥花期對重度的干旱脅迫最為敏感所致?；ㄆ谑寝见湢I養生長階段和生殖生長期開始階段，干旱脅迫可導致其開花延遲、脫落，影響其子粒的形成，降低產量。董馥慧等[59]研究干旱脅迫對苦蕎不同生育時期的影響，發現花期為最敏感時期，受干旱影響最大，其POD，MDA，Pro含量顯著高于對照，SP含量顯著低于對照。SP的變化與本研究有所不同，可能是藜麥比苦蕎有更強的干旱耐受性所致。孫建等[60]研究輕、中、重3種干旱脅迫對芝麻花期生理指標的影響，發現葉片中的POD，SOD，Pro，SP和MDA隨著脅迫程度的加劇呈不斷上升趨勢。

3.2 水分脅迫與代謝物的關系

水分脅迫后，干旱脅迫、水澇脅迫組與CK的代謝物均有顯著差異。干旱脅迫組中總共篩選出60個差異代謝物，大部分為下調表達。差異代謝物注釋到46條代謝通路，極顯著的通路有4條，分別是氨酰-tRNA生物合成、二羧酸代謝、甘氨酸-絲氨酸和蘇氨酸代謝、吲哚生物堿合成。這些通路可能與抗干旱機制密切相關。水澇脅迫組中總共篩選出74個差異代謝物，大部分為上調表達。差異代謝物注釋到47條代謝通路，極顯著的通路有3條，分別是氨酰-tRNA生物合成、二羧酸代謝、吲哚生物堿合成。這些通路可能與抗水澇機制密切相關。干旱脅迫與水澇脅迫的差異代謝物通路基本一致，差異代謝物種類也基本一致，主要是氨基酸類、有機酸類、脂肪酸類、糖類和一些多酚、生物堿、胺類、核苷衍生物，其中色氨酸、丙氨酸、纈氨酸、絲氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、脯氨酸、高絲氨酸、甘氨酸、組氨酸、色胺、甘油酸、異檸檬酸是抗干旱的關鍵代謝物質，異檸檬酸、甘氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、絲氨酸、異亮氨酸、組氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、色胺是抗水澇的關鍵代謝物質。馮瑛[61]通過代謝組學分析櫻桃砧木的抗旱性機制，發現上調的差異代謝物主要是有機酸、氨基酸、碳水化合物和生物堿等，且最終將奎尼酸、苯丙氨酸、3-氰丙氨酸、天冬酰胺、對苯醌和植物鞘氨醇確認為干旱響應候選指示代謝物。吳棟等[62]分析水澇脅迫下煙草的代謝產物，發現主要上調的代謝物是氨基酸(脯氨酸、谷氨酸、絲氨酸和組氨酸等)，有機酸(肉桂酸、阿魏酸、綠原酸和蘋果酸等)，多酚和生物堿。趙妍[63]研究狗牙根干旱的代謝產物，總共鑒定出44種代謝產物，包括15種有機酸、14種氨基酸、10種糖與糖醇、3種脂肪酸及2種含氮化合物。還發現顯著上調的代謝物與抗旱密切相關，包括3種有機酸，3種氨基酸，5種糖與糖醇，2種不飽和脂肪酸及2種含氮化合物。但本研究中藜麥花期在受到干旱脅迫后，主要的代謝物質表達下調，可能是由于本試驗采用的是質量分數為30%的PEG-6000進行重度干旱脅迫，而花期又是藜麥的水分敏感期。長時間的重度干旱脅迫可能使得藜麥葉片光合能力降低，導致電子傳輸鏈過度還原，從而導致光氧化。此外，植物雖然可以通過調節自身的抗氧化系統和代謝酶活性來應對氧化損傷，但其調節能力存在著一定限度。當氧自由基生成的速率遠大于抗氧化系統的調節能力時，植物的氧自由基會過度積累，從而對膜系統產生不可逆的損傷，導致內部代謝調節紊亂，蛋白質大量降解，細胞裂解死亡。因此，干旱脅迫組中大量的氨基酸類表達下調。而水澇脅迫組中，藜麥雖受到了脅迫，引起了氧自由基的產生，但由于其脅迫的程度在植物可承受的范圍內，可通過自身抗氧化系統的調節來應對氧化損傷，使得植物的ROS和MDA含量維持在一個動態平衡，且較CK組無明顯差異，植物能進行正常的代謝活動。因此，水澇脅迫組中大量的氨基酸和有機酸類表達上調。

藜麥花期在受到干旱和水澇脅迫后，響應機制有一定的相似之處。葉片中的SP含量降低，但較CK組變化不顯著，WSS含量、POD活性和T-AOC均顯著增加。但由于花期為水分敏感期，重度干旱脅迫對植物細胞損傷極大，使得氧自由基的生成速率超出了植物抗氧化系統調節的范圍，導致氧自由基的過度積累，對膜系統產生不可逆的損傷，導致內部代謝調節紊亂，蛋白質大量降解失活，細胞裂解死亡。使得植物中的代謝物質(尤其是大量的氨基酸類)表達下調，而水澇脅迫組中的MDA變化不顯著。這是由于水澇脅迫，引起氧自由基的產生與抗氧化系統的調節，維持了動態平衡，保證了膜系統的完整性，從而可進行正常的生理代謝活動。通過代謝物質以及相關通路的分析，還發現藜麥在水澇脅迫下，主要通過氨基酸類富集的氨酰-tRNA生物合成途徑，有機酸和糖類富集的二羧酸代謝途徑、生物堿富集的吲哚生物堿合成途徑來抵御脅迫，保持植物的正常生理活動。

綜上所述，藜麥花期在干旱和水澇脅迫下的生理和代謝調節機制十分相似，但對重度干旱脅迫抗性較差，時間過長會嚴重損害植物細胞。因此，在生產實際中更應該注意花期的水分管理，避免長期干旱導致藜麥的產量和品質下降。