候選結核疫苗的評價模型

楊淑鳳， 鄧國英， 白 璐， 孫文長*

(1.大連醫科大學 微生物學教研室，遼寧 大連 116044; 2.大連市海關技術中心，遼寧 大連 116022)

卡介苗(Bacille Calmette-Guerin，BCG)作為唯一合法使用的預防結核病疫苗，在一定程度上能降低兒童播散性結核，例如結核腦膜炎和粟粒性結核的發病，但無法提供充足的保護力。所以結核病依然是嚴重威脅人類健康的疾病。尤其是多重耐藥結核(multidrug-resistant TB，MDR-TB) 和泛耐藥結核(extensively drug-resistant TB，XDR-TB)的出現。僅2016年，在全球確證的662萬結核病例中就有約15萬MDR-TB，8千余例XDR-TB[1]。因此篩選更高保護力的候選疫苗迫在眉睫。到目前為止，約有12種處在不同臨床試驗階段的候選疫苗[1]，這些疫苗在進入臨床試驗前必須評價其安全性、免疫原性和有效性[2]。本文從體內和體外兩個方面論述臨床試驗前的疫苗評價體系，對候選疫苗評價體系的充分認識是篩選優質候選疫苗的重要依據。

1 體內評價體系

1.1 結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis, M. tb)攻擊模型

1.1.1 攻擊對象 使用M.tb攻擊模型來評價候選疫苗的有效性，是指在疫苗接種后讓動物感染M.tb。攻擊菌株多為標準毒株H37Rv，常使用的動物包括小鼠、豚鼠以及非人類靈長類(non-human primates, NHP) 動物等。小鼠因其低成本、大樣本數據易獲得以及易于標準化實踐操作等優點，已成為疫苗評價中最普遍使用的初篩動物模型，常采用C57Bl/6、BALB/c以及C3HeB/FeJ等品系。值得一提的是，使用C3HeB/FeJ品系的小鼠建模能形成中性粒細胞滲出、損傷嚴重并發展為液化為主要特征的病灶，與人體結核滲出液化病灶非常相似[3]，因此，很多候選疫苗多采用C3HeB/FeJ品系建模。此種小鼠模型與人暴露在活動肺性結核的高風險非常相似，因此也常用于控制此類人群感染的疫苗評價[4]。需要指出的是，小鼠缺乏針對M.tb糖脂抗原所必需的CD1b[5]。豚鼠模型多應用于經過小鼠模型初篩成功的候選疫苗的進一步有效性評價，而豚鼠模型的結果往往也是該候選疫苗能否進入臨床試驗的重要“門檻”[5]。非人靈長類動物因其與人類近源性、高度相似的免疫反應，成為評價候選疫苗進入臨床試驗中最具有吸引力的工具[6]，但因高成本及對人員專業性的要求，使得NHP模型僅應用在經過小鼠模型、豚鼠模型篩選后的進一步確證中。

1.1.2 攻擊途徑M.tb攻擊模型常用的攻擊途徑為低劑量氣溶膠。以小鼠模型為例，在設備封閉空間里，利用2 μm的氣溶膠，通過呼吸道使小鼠肺部接種50 CFUs(colony forming units)的M.tb[7]。低劑量氣溶膠途徑建立的攻擊模型，僅能模擬人群感染M.tb后損傷被控制或者細菌增殖但又不引起滲出和空洞的免疫狀態。此外，在低劑量氣溶膠方法基礎上建立模型后，持續使用抗結核藥物至病灶中僅存耐藥M.tb，則能建立起潛伏感染小鼠模型。此模型常用于評價某些治療型疫苗的效果[8]。 除氣溶膠途徑外，還有氣管內接種途徑，通過大劑量(1×106CFUs) 的M.tb氣管內接種，形成吸入性肺炎。氣管接種途徑目前主要應用于M.vaccae候選疫苗的測試[9]。目前認為此類疫苗有助于Th2反應轉變為Th1反應[9]。最新的一個BCG接種途徑研究可以說是結核疫苗領域中的一個重大革新：改變傳統的BCG接種途徑，經靜脈注射免疫恒河猴。發現這種免疫接種途徑能在恒河猴體內誘導出針對M.tb接近100%的保護力[10]。這個重大發現也說明BCG產生免疫保護的機制應該是細胞免疫、體液免疫和固有免疫的綜合作用結果[10]。

1.1.3 評價指標M.tb攻擊模型常用的評價指標包括肺部荷菌量、肺部病理評分以及受試對象的存活期。而候選疫苗優于傳統BCG的標準則是在攻擊3周后，肺部的荷菌量相對于對照組至少要降低0.7 log10CFUs以上[2]。需要指出的是，無論哪種動物模型都不能完整地模擬出人類M.tb的感染狀態。

1.2 BCG攻擊模型

1.2.1 攻擊對象 BCG攻擊模型最大的優勢就是受試對象可以是人，這在候選結核疫苗有效性評價中最具應用前景。在可控的條件下，以人作為受試對象來評價疫苗的有效性，在瘧疾疫苗[11]和傷寒疫苗[12]研究中有過先例。BCG作為活菌疫苗非常安全，可在人體內短期存活復制，能夠引起可控的短期分枝桿菌感染，可使用BCG攻擊人[13]。此外，在疫苗篩選最初階段，在實驗室階段達不到人體使用標準時，也可以使用動物作為BCG攻擊的受試對象，例如兔子[14]。BCG攻擊模型規避了專業實驗室的局限(M.tb攻擊必須在生物安全級別為3級的實驗室操作)和人員感染的風險，在候選疫苗評價中極具應用前景。

1.2.2 攻擊途徑 目前報道，BCG攻擊的途徑為受試對象皮內注射。通過在志愿者皮內接種標準劑量的BCG和安卡拉病毒85A疫苗(Modified virus Ankara expressing the conserved mycobaterial 85A，MVA85A)，兩周后活檢攻擊部位的組織，評價人體的抗結核免疫能力[13]。由于皮內注射與M.tb實際感染方式存在差異，因此，BCG氣溶膠攻擊模型還在探索中[15]。

1.2.3 評價指標 BCG攻擊模型的評價指標是通過測定攻擊部位活體組織的BCG荷量反映，即CFUs數目以及菌DNA定量，來反映人體的抗結核免疫能力[13]。此外，通過對攻擊劑量的比較，發現在志愿者能承受范圍內，高劑量組(即3倍于標準劑量)結果檢測更為靈敏[13]。

1.3 其他模型

出于人道主義以及動物的替代、減少和優化(replacement, reduction and refinement，3R)原則，低感知的動物模型也應用在結核疫苗評價研究中[15]。低感知動物包括阿米巴、果蠅和斑馬魚等。尤其是海洋分枝桿菌(Mycobacteriummarinum)感染的斑馬魚能模擬出人類結核病急性和潛伏感染狀態，因此，也是很多治療性疫苗和DNA疫苗經常使用的模型[15]。

2 體外評價體系

盡管還沒有明確的生物標記預示機體對M.tb的保護力，但一些候選疫苗的評價結果也揭示了某些免疫細胞和抗體與M.tb保護力相關，例如在MVA85A的IIb臨床測試中，雖然結果顯示接種和未接種與傳統BCG并無明顯的保護力差異，但分泌IFN-γ的BCG抗原特異的T細胞和高效價的Ag85A IgG與M.tb保護力相關[16]。這些與免疫保護相關的生物標記物的確定加快了候選疫苗的研發，某種程度上也推動了候選疫苗進入臨床前試驗的進程，為候選疫苗進入臨床I期試驗提供了有效的免疫原性相關檢測指標。目前應用最多的體外評價指標是結核菌生長抑制試驗(mycobacterial growth inhibition assays，MGIAs)等。

2.1 MGIAs

MGIAs是指在體外將巨噬細胞等和M.tb等共培養，模擬分枝桿菌感染后，加入疫苗接種前后受試對象的全血或者某些類型免疫細胞，如淋巴細胞，通過評價機體或者特種類型免疫細胞對M.tb生長的抑制能力，來反映該疫苗的有效性。受試對象可以是人，也可以是動物(如?；蛘咝∈?。MGIAs檢測的M.tb也不限H73Rv標準毒株，還可以是分離到的各種臨床強毒株[17]。此外，MGIAs也避免了對動物的體內攻擊，是對動物3R原則的很好體現。MGIAs除了主要反映Th1類細胞對M.tb的清除能力外，還反映了體液免疫如特異抗體、天然免疫細胞包括抗原遞呈細胞(樹突細胞)、自然殺傷細胞和中性粒細胞等對M.tb的清除能力[17]。

2.2 生物信息學和數學模型

已知M.tb和宿主的基因序列，同樣能應用生物信息學方法進行計算機推演來確定候選結核疫苗[15]，例如熟知的BCG與M.tb基因序列相比較后確定的差異區域RD(region of difference)，很多亞單位疫苗成分是RD蛋白；通過生物信息學方法分析RD蛋白與人類白細胞抗原I等位基因的親和力，根據高親和力確定潛在的候選疫苗抗原；生物信息法還可以確定潛在的激活人類CD8+T細胞的M.tb抗原[18]。此外，隨著電子技術的快速發展，很多數學對接模型、抗原預測軟件不斷產生和更新，例如基于VaxiJen預測抗原軟件和氨基酸序列比對原理的NERVE(new enhaced reverse vaccinology enviroment)預測的6個候選結核疫苗[19]。這些數字化模型更體現低成本、高效性和精準性，也是對體內動物模型3R原則的體現和運用。

3 疫苗評價模型數據解析時需考慮的因素

3.1 體內模型的種屬差異

體內模型，如目前廣泛使用的動物模型，與人類的種屬差異影響其結果對人類臨床試驗的預測。NHP模型雖然近源，但也因其高成本和倫理學等因素使其不能作為常規篩選模型。正因為如此，NHP模型更應統一流程并規范影響因素，以便不同地區課題組的數據具有比較性和綜合分析性，最大化發揮NHP模型的價值。被寄予厚望的MVA85A，在小鼠模型、豚鼠模型、NHP模型以及牛等體內的表現均優于傳統BCG的保護，但在嬰幼兒的臨床IIb試驗中并未表現出優于傳統BCG的保護力[16]，說明也許種屬差異是其中的原因，另外也可能是在MVA85A的IIb臨床測試中，受試對象年齡差異導致，動物模型受試者均為成年，而臨床試驗對象為嬰幼兒[20]。因此，體內模型數據對候選疫苗進入臨床試驗的意義重大，有賴于更多M.tb保護力的生物標記物的確證。

3.2 體內模型的攻擊菌株和暴露時間

體內模型(如動物模型)采用的攻擊菌株多為單一的實驗室可控標準毒株H37Rv，感染方式多為持續暴露在高劑量的感染源環境中。人群感染M.tb涉及多個免疫機制的復雜過程，而衡量疫苗保護力的唯一標準是是否感染M.tb。加上目前臨床分離的菌株及其毒性和耐藥性多樣，與實驗室標準株有差異，因此，菌株和暴露時間也影響體內動物模型對人群臨床試驗的預測。

3.3 臨床試驗設置

人群臨床試驗綜合考慮因素眾多，包括受試對象的年齡、性別、BCG成疤歷史等。要綜合首要設定因素遴選受試對象[21]。試驗受干擾的因素也很多，包括飲食、對環境中其他分枝桿菌和寄生蟲等病原體的暴露程度等等，而這些因素在臨床前的體內外評價模型中可被規范并降低[2]。因此臨床試驗的復雜試驗參數也影響臨床前的體內外模型數據在人群臨床試驗重現。MVA85A的IIb臨床試驗沒有再現臨床試驗前動物模型的保護力，就是一個實例[21]。

3.4 疫苗保護效果的界定

目前，對候選疫苗的篩選都是以保護力是否高于BCG為標準的，BCG在人群中的保護力約為60%[2]。動物模型中對候選疫苗有效性的界定，依據的是對疾病相關癥狀如肺脾的荷菌量、病理表現以及存活期等與BCG對照組是否具有統計學差異。而在人群試驗中，這些依據則不能作為界定標準，人群中對疫苗保護力界定的唯一標準就是感染M.tb。很多候選疫苗在動物模型中能降低0.5～1.0 log10CFUs的荷菌量， 這對于其在人群中阻止感染的程度還不得而知[2,20]。

4 小 結

到目前為止，所有的候選疫苗還沒有一個能在評價模型中預防M.tb感染的發生。而人類感染結核是個非常復雜的過程，結果既有感染痊愈者，又有潛伏感染者，還有復發者以及活動性和播散性結核[22]。在目前缺乏疫苗保護力界定標準的情況下，進行臨床試驗前評價依然是篩選候選疫苗的首選。對候選疫苗評價模型的充分認識和模型數據的充分利用將有利于提高評價模型對人群的預測價值，也是動物3R人文精神的體現。